HNF1α，HNF4α，FOXA3聯合應用誘導肝癌細胞重編程.pdf

1、目的:
　　肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第六位，病死率居第二位。盡管近年來肝癌的診療技術不斷發(fā)展，其早期診斷困難、放化療不敏感和復發(fā)轉移率高的現狀沒有根本改觀。唯一被FDA批準用于肝癌的靶向治療的藥物索拉非尼，治療效果非常不理想。因此，肝癌的治療研究亟需調整思路，尋找更加有效的治療手段。
　　腫瘤的誘導分化是近些年興起的一種治療方法，分化治療可誘導低分化的腫瘤細胞向成熟表型分化，抑制其增殖和轉移并

2、促進其凋亡，從而達到治療腫瘤的目的。迄今分化治療應用最好的是利用全反式維甲酸治療急性早幼粒白血病，已有大量的病人獲得了很好的治療效果。血液腫瘤分化治療的成功也帶動了實體腫瘤的分化治療研究，相繼出現了應用全反式維甲酸、二甲基亞砜和砷劑治療乳腺癌、肺癌、結腸癌的研究，但肝癌的分化治療研究目前還很少。
　　肝細胞核因子(Hepatocyte nuclear factor,HNF)是一類在肝細胞中相對特異性高表達的轉錄因子，在肝細胞的分化

3、和功能維持方面發(fā)揮重要作用。HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)以及D-結合蛋白(DBP)6大類因子。已有研究顯示單獨應用HNF1α或HNF4α導入HNF1α或HNF4α低表達的肝癌細胞后，可以誘導肝癌細胞分化。但在相當一部分肝癌中HNF1α或HNF4α的表達并不降低，對這部分肝癌而言，單獨應用HNF1α或HNF4α療效有限。此外，將多種肝細胞核因子聯合導入肝癌細胞協(xié)同發(fā)揮作用，

4、理論上誘導肝癌細胞分化的效果可能更好。前期有學者從肝細胞特異性轉錄因子中篩選能誘導人成纖維細胞向肝細胞轉分化的轉錄因子，最終篩選到了HNF1α、HNF4α和FOXA3(HNF3γ)。將這三種因子聯合轉入人成纖維細胞后，可將人成纖維細胞誘導成肝細胞(hiHeps，humaninduced hepatocytes)。hiHeps形態(tài)類似正常肝細胞，且具有肝細胞的標志物和生物學功能。
　　在前期研究的基礎上，本課題旨在聯合應用HNF1α

5、、HNF4α和FOXA3抑制肝癌惡性表型并誘導肝癌細胞向肝細胞重編程;希望藉此探索腫瘤細胞重編程的可能性及其可能機理，為癌癥的治療提供新的思路與方向。
　　方法:
　　1.通過realtime-RCR檢測不同肝癌細胞系及正常肝細胞中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表達情況。
　　2.通過免疫組織化學法檢測肝癌組織芯片中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表達情況。
　　3.分別構建表達HNF1α、HNF4α和

6、FOXA3的三種腺病毒，并用realtime-PCR和蛋白印跡法(Western blot)驗證表達三種因子的腺病毒感染肝癌細胞后的表達情況。
　　4.將HNF1α、HNF4α和FOXA3腺病毒感染肝癌細胞后，通過realtime-PCR檢測肝細胞相關功能基因的表達水平。
　　5.通過相差顯微鏡觀察三因子誘導后肝癌細胞的形態(tài)改變。
　　6.利用基因芯片檢測并比較三因子誘導的肝癌細胞與對照細胞以及人原代肝細胞的基因表達差

7、異。
　　7.采用PAS、油紅染色、LDL攝取、尿素及白蛋白分泌等肝功能相關實驗，檢測三因子誘導后的肝癌細胞肝功能的改善情況。
　　8.通過流式細胞術及細胞成球實驗檢測三因子對肝癌干細胞的誘導分化。
　　9.通過CCK8、克隆形成、transwell實驗檢測三因子誘導后肝癌細胞的惡性生物學特性改善情況。
　　10.建立PDX(patient-derived xenograft)模型并通過瘤內注射三因子腺病毒，研究

8、其體內治療肝癌的效果。
　　結果:
　　1.不同肝癌細胞系中HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細胞核因子的表達水平有較大差異。
　　2.肝癌樣本中的三因子表達存在異質性，且大多數癌中三因子表達均低于癌旁。
　　3.聯合應用HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細胞核因子能上調肝癌細胞中大量肝功能相關基因表達，且三因子聯合應用的效果顯著優(yōu)于HNF1α、HNF4α、FOXA3單因子及兩兩組合(1+4、1+F、

9、4+F)的效果。
　　4.經三因子誘導后肝癌細胞的形態(tài)較對照細胞更加扁平寬大，接近肝細胞的形態(tài)。
　　5.基因芯片分析顯示三因子誘導后肝癌細胞與對照細胞差異很大，其可以和人原代肝細胞聚類。
　　6.三因子誘導后肝癌細胞的肝細胞相關功能，如糖原合成、脂質堆積、白蛋白攝入等較對照細胞得到很大改善。
　　7.三因子聯合應用能顯著下調肝癌細胞中肝癌干細胞的比例并抑制其自我更新能力。
　　8.經三因子誘導后肝癌細胞的

10、惡性表型幾近消失。
　　9.PDX中注射三因子腺病毒可有效抑制肝癌生長并能增強其ALB表達并降低AFP表達。
　　結論:
　　HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細胞核因子的在不同肝癌細胞中表達量差異較大,且大多數肝癌中三種因子表達均低;單一及兩兩組合的誘導效果遠不及三種因子聯合應用;經過三因子誘導的肝癌細胞不僅其惡性生物學特性得到抑制，還表現出較好的肝細胞形態(tài)和功能，提示三因子聯合應用可能誘導肝癌細胞向肝細胞重編