HNF4及其配體棕櫚酸在肝細胞中對ACAT2的轉錄調節(jié).pdf

1、心血管疾病是威脅人類生存和影響生存質量的重要疾病，在發(fā)達國家，心血管疾病已經超過腫瘤，成為威脅人類生存的第一殺手。心血管疾病往往伴隨動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，而在動脈粥樣硬化的發(fā)生中，血中膽固醇水平的改變被認為是重要的始動因素。因此，研究膽固醇的代謝，對于理解動脈粥樣硬化有重要意義。
　　 ACAT是脂酰輔酶A膽固醇酰基轉移酶(acyl-coA cholesterol acyltransferase)，催化膽固醇和脂酰輔酶A生成膽

2、固醇酯，加上的脂肪酸烴鏈使膽固醇酯的疏水性較游離性膽固醇的疏水性大大增加，分子間可以通過疏水性相互作用大量堆積在一起，極大地增加了堆積密度。ACAT分為ACAT1型和ACAT2型。ACAT1幾乎在所有組織中有表達，而ACAT2只在肝腸組織中表達。ACAT2催化的膽固醇酯由于有很強的疏水性，在肝中可以與甘油三酯，ApoB組裝成VLDL顆粒并分泌到血中。ACAT2被認為與血中LDL中的膽固醇酯水平緊密相關：在細胞水平，ACAT2在肝細胞的過

3、表達可以促進VLDL和ApoB的分泌；在動物水平ACAT2來源的膽固醇酯被認為是血液中致動脈粥樣硬化的主要酯類，ACAT2的敲除鼠肝臟中VLDL和ApoB的分泌減少，血液中膽固醇酯水平明顯降低，并且對于動脈粥樣硬化有抵抗作用；通過寡核苷酸的方法干擾小鼠肝臟ACAT2之后，ApoB的分泌減少，血液中膽固醇酯顯著降低，小鼠對動脈粥樣硬化斑塊抵抗能力增強。因此，ACAT2被認為是很有潛力的治療靶點?；贏CAT2對于膽固醇代謝的明確作用，研究

4、ACAT2的調控具有重要意義。雖然已經知道ACAT2可以受到膽固醇別構效應的調節(jié)，但是，關于ACAT2是否受到不同因素引起的轉錄調控，還沒有報道。為了觀察不同的飲食和營養(yǎng)因素對于膽固醇酯代謝的調節(jié)作用，我們對ACAT2的轉錄調控進行了研究。
　　 首先，我們構建了ACAT2的報告基因，通過觀測其在肝細胞和非肝細胞中的啟動子活性，我們發(fā)現ACAT2的啟動子在非肝細胞中本底轉錄水平很低，這與其啟動子上不含經典的TATA box相一致

5、；在肝細胞中ACAT2的轉錄活性主要受肝特異性因子調控。通過構建一系列截短的啟動子的報告基因并在肝細胞和非肝細胞中觀察活性，我們發(fā)現了兩個可能的HNF4的結合位點。通過報告基因，我們發(fā)現HNF4可以增加ACAT2啟動子的活性。通過構建結合位點突變的報告基因，以及通過EMSA和ChIP實驗，我們證實了HNF4可以通過這兩個位點結合到ACAT2的啟動子上發(fā)揮作用。這兩個位點中，位點Ⅰ在-780～-790bp的位置，位點Ⅱ在-20～-30bp

6、的位置，位點Ⅱ的突變導致報告基因的活性完全缺失，與PGL3-Basic相當，我們認為HNF4可能通過該位點維持基礎轉錄水平，而通過位點Ⅰ增強ACAT2的表達。另外，通過腺病毒過表達，我們發(fā)現HNF4可以顯著上調ACAT2的表達，而在逆轉錄病毒介導的HNF4干擾的穩(wěn)定克隆細胞系中，ACAT2顯著下調。這些實驗確認了HNF4對ACAT2具有上調作用。
　　 脂肪酸可以分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。這兩類脂肪酸對于膽固醇代謝的影響已有

7、很多研究。一般認為，飽和脂肪酸可以顯著上調血液中LDL-膽固醇的含量。脂肪酸可以作為HNF4的配體發(fā)揮作用，因此我們設想飽和脂肪酸調節(jié)ACAT2，進而通過改變ACAT2的表達量影響到膽固醇的代謝。為了觀察飽和脂肪酸處理細胞對ACAT2表達的影響，我們選用生理狀態(tài)下飽和脂肪酸含量最高的棕櫚酸處理人肝細胞系HepG2和HuH7和原代培養(yǎng)的小鼠肝細胞，發(fā)現棕櫚酸非常明顯地上調ACAT2的表達，而在對照BSA組和不飽和脂肪酸油酸處理組，ACAT