乙型肝炎病毒X蛋白對人肝癌細胞系HepG2中HNF-4α及NF-κB表達的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒X 蛋白對人肝癌細胞系H e p G 2 中H N F ．4 Q 及N F ．K B 表達的影響摘要l 目的本實驗研究利用基因轉染技術使人H e p G 2 細胞過表達x 基因，通過細胞培養(yǎng)、細胞流式、熒光顯微鏡及P C R 、W e s t e r nB l o t 等方法來探討X 基因對其H N F - 4 a 及N F ．KB 表達的影響從而了解X 基因與H N F ．4 Q 、N F ．xB 及肝癌細胞的關系。2 方

2、法將H e p G 2 人肝癌細胞分為3 組：轉染H B x 細胞組：用脂質體轉染法將H B x 真核表達載體p c D N A 3 ／H B x 瞬時轉入H e p G 2 細胞；以轉染空載體細胞組和未轉染H e p G 2 細胞組作為對照組。通過顯微鏡下觀察對比肝癌細胞培養(yǎng)的生長情況，以細胞流式及熒光顯微鏡檢測不同組的肝癌細胞增殖情況，P C R 檢測各組X 基因表達，H N F - 4 a 及N F ．KB 的r n R N A

3、表達情況，W e s t e r n B l o t 檢測N F ．KB 蛋白的表達情況，來探討X 基因對其H N F - 4 g t 及N F ．xB 表達的影響。3 結果3 ．1 一般情況H e p G 2 肝癌細胞培養(yǎng)在含1 0 ％胎牛血清的培養(yǎng)液中，以脂質體轉染的方法分別分成轉染H B x 細胞組，轉染空載體細胞組和未轉染H e p G 2 細胞組。轉染H B x 細胞組的H e p G 2 肝癌細胞于3 7 。C 孵育7 2

4、小時，生長較其他兩個組的肝癌細胞密集。轉染空載體細胞組和未轉染H e p G 2 細胞組的細胞生長一般，未見異常增殖。3 ．2 各組細胞的細胞流式增殖分析及熒光顯微鏡圖像分別將轉染H B x 細胞組，轉染空載體細胞組和未轉染H e p G 2 細胞組的細胞通過細胞流式和熒光顯微鏡分析細胞的增殖情況。細胞流式增殖分析：細胞流式儀檢測各組的細胞增殖情況，轉染H B x 細胞組肝癌細胞處于增殖期D i pG 2 ：5 ．6 8 ％a t1 9

5、 2 ．2 1 。熒光顯微鏡圖像：轉染H B x 細胞組的H e p G 2 肝癌細胞于3 7 “ C 孵育7 2 小時處于增殖期的細胞比率為O ．4 7 。轉染空載體細胞組處于增殖期的細胞比率為O ．2 8 。未轉染H e p G 2 細胞組處于增殖期的細胞比率為0 ．2 5 。3 ．3 R T - - P C R 法檢測檢測肝癌細胞內H N F ．4 a 及N F ．KB 的基因的表達。檢測轉染H B x 細胞組，轉染空載體細胞組及

6、未轉染H e p G 2 細胞組中肝癌細胞內H N F ．4 Q 及N F ．K B 基因的表達情況。轉染H B x 細胞組中H N F - 4 a 的表達值為T h e e f f e c t o f H e p a t i t i sB v i r u sX p r o t e i n t oH N F 一4 Q a n d N F —k B o nh u m a n H e p G 2 h e p a t o c a r c i

7、m o n a c e l lA B S T R A C T1 P u r p o s eT h i s s t u d yi n v e s t i g a t e dt h e H e p G 2 l i v e r c a n c e rc e l l sw h i c h a r e t r a n s e c t e db yX g e n eo fl i p o s o m e ，t h e n e x p l o r et

8、 h ee x p r e s s i o n o fX g e n e ，H N F - 4 C t a n dN F - 1 ①t h r o u g hc e l lc u l t u r e ，c e l lf l o w , f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y a n d P C R , W e s t e r n B l o t ．I ti si n v e s t i g

9、a t e dt h er e l a t i o no f X g e n e ．H N F 一4 aa n d N F —k a p p a B i nl i v e r C a n C e l “ c e l l s 。2 M e t h o d sT h e H e p G 2 a d u l t l i v e rc a n c e rc e l l s a r ed i v i d e di n t ot h r e eg

10、r o u p s ：t r a n s f c c t c d w i t h H B xc e l l sG r o u p ，c e l l st r a n s f e c t e dw i t h e m p t y v e c t o rg r o u pa n du n t r a n s f e c t e dH e p G 2 c e l l sa sc o n t r o l g r o u p ．C o n t r

11、 a s tt O l i v e r c a n c e r c e l l s g r o w t hb ym i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n ，t h ep r o l i f e r a t i o n o fh e p a t o m a c e l l s b y c e l l - f l o wa n d f l u o r e s c e n c e m i c r o

12、 s c o p y t o d e t e c td i f f e r e n tg r o u p s ．T h ee x p r e s s i o no fX g e n e 。H N F - 4 q a n d N F —KB n u c l e a rR N A a r ed e t e c t e db y P C R i ne a c hg r o u p ．T h e e x p r e s s i o n o f

13、N F - K B n u c l e a r p r o t e i ni sd e t e c t e db yW e s t e r n b l o tt oe x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h e X g e n ea n d N F - r d 3 ．3 R e s u l t s3 ．1 G e n e r a lH e p G 2c e l

14、 l s w e r ec u l t u r e d i nm e d i u mc o n t a i n i n g 1 0 ％f e t a l b o v i n e s e r u l n ．T h eg r o w t h o f l i v e rc a n c e r c e l l si nt r a n s f e c t e d X g e n eg r o u p g r o w t hb e t t e rt

15、 h a n t h e o t h e rt w og r o u p s a t3 7 ℃1 0 ％f e t a lb o v i n e s e r u w lf o r 7 2 h o u r s ．3 ．2 e a c hg r o u po fc e l l s s t r e a m i n gp r o l i f e r a t i o na n a l y s i s a n df l u o r e s c e

16、n c em i c r o s c o p yi m a g e sT h e f l o wc e l l p r o l i f e r a t i o na s s a y ：T h eH e p G 2 c e l l sw h i c h i s i n t h et r a n s f e c t e dH B xg r o u p a r e d e t e c t e dt h ec a s eo f p r o l

17、i f e r a t i o nu n d e r3 7 。C i n6 w e l l p l a t e sa n d i n c u b a t e df o r7 2 h o u r s ．T h er a t e o f p r o l i f e r a t i o ni St h a t D i p ( 3 2 i s5 ．6 8 ％a t1 9 2 ．2 1i nt h eh e p a l o m ac e l l

18、s ．F l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p yi m a g e s ：t h er a t eo f p r o l i f e r a t i o ni st h a tt r a n s f e c t e dH e p G 2 c e l l si S0 ．4 7i n c u b a t e d a t3 7 ℃f o r 7 2 h o u r s ．I t i sm o r e

19、 t h a no t h e r t w o g r o u p s ．3 ．3T h e e x p r e s s i o no f 姐盯．4 c ta n d N F —KB d e t e c t e db yR T - P C R m e t h o di nl i v e rc a n c e re e l I s ．T h e e x p r e s s i o nv a l u eo f H B x t r a n s