乙型肝炎病毒X蛋白上調(diào)共抑制分子B7-H1在肝癌細胞中的表達.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為部分雙鏈環(huán)狀DNA的嗜肝病毒，HBV感染可致急、慢性肝炎，持續(xù)HBV感染同原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的進展密切相關。目前全球有3.5億HBV慢性攜帶者，每年約1百萬死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化、原發(fā)性肝癌。
　　 早期研究認為HBV病毒DNA整合肝細胞基因組可激活癌基因或失活抑癌基因，從而誘發(fā)肝癌，但其致癌作用未得到

2、完全證實。對HBV病毒基因組的研究表明，HBV基因組主要翻譯4種蛋白，即：HBV多聚酶蛋白(HBP)、表面抗原(HBS)、核心抗原(HBC)及X蛋白(HBx)。一些體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，HBx可誘導肝細胞的惡性轉化及癌變；實驗動物研究也發(fā)現(xiàn)X基因的轉基因小鼠可誘發(fā)肝癌(HCC)的發(fā)生。進一步的研究則提示，HBx本身并不具備直接的致癌效應，而是作為反式激活因子并有效地激活胞內(nèi)的AP-1、AP-2、ATF/CREB、NF-kB、c/EBP、PI-

3、3K及Egr-1等多種效應分子及信號傳導途徑來誘導肝癌形成。此外HBx與p53蛋白結合后，在蛋白水平使靶細胞中抑癌基因及其產(chǎn)物的功能發(fā)生改變；并可通過影響正常的細胞周期，干擾DNA的修復及調(diào)節(jié)肝細胞增殖、分化和凋亡，在HBV病毒感染及原發(fā)性肝細胞癌(HCC)發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用。雖然有關HBx在HBV誘發(fā)肝癌中的研究取得了一定地進展，但HBx如何誘導HCC的發(fā)生，其確切的機制尚未清楚。
　　 共刺激分子是一類細胞膜表面分子，其

4、可為T、B細胞的活化提供輔助信號，從而調(diào)節(jié)細胞增殖、活化及分化。而缺乏共刺激信號的抗原刺激易引起T細胞的耐受、無反應性和細胞調(diào)亡。最近，在共刺激分子與腫瘤相互關系的研究中，人們的注意力集中在了新型的B7家族共刺激分子尤其是B7-H1的身上。B7-H1是近年發(fā)現(xiàn)的一種對T細胞的活化及存活起重要調(diào)節(jié)作用的共刺激分子。對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1廣泛表達于各種腫瘤細胞并通過B7-H1/PD-1途徑誘導腫瘤的免疫逃避，B7-H1引起的效應性細胞

5、凋亡是腫瘤細胞免疫逃避的一種重要機制。近來研究發(fā)現(xiàn)B7-H1高表達的肝癌病人比低表達的病人不良預后幾率顯著增加，提示B7-H1可能是肝癌病人復發(fā)的一種新的預測分子。
　　 很明顯HBx和B7-H1均參與了肝細胞癌的發(fā)病進程，然而它們在肝癌發(fā)生過程中是否存在某種聯(lián)系?德國雷根斯堡大學研究小組證實HBV感染肝細胞后上調(diào)B7-H1的表達，而HBx在HBV復制中起重要作用，因此我們提出這種假設：HBx可能通過激活B7-H1信號促進肝癌的

6、形成。為了驗證這種假設，首先我們根據(jù)adr亞型HBV基因組序列設計擴增HBV x基因的PCR引物，擴增HBV x基因片段，與真核表達載體pcDNA3.1(+)構建重組子，經(jīng)雙酶切和測序鑒定后命名為pcDNA3.1(+)/HBx。轉染HepG2細胞經(jīng)抗生素G418篩選后獲得穩(wěn)定表達HBV X蛋白的HepG2細胞系，命名為HBx+-HepG2細胞，轉染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細胞系命名為HBx--HepG2細胞，并經(jīng)細胞免疫

7、化學染色、Western-blotting及細胞流式技術分析鑒定HBV x蛋白在細胞中的表達。然后我們利用基因芯片技術，分析HBx轉染肝癌細胞株引起的表達譜變化，所用芯片為Operon公司的35k human Genome Array，利用該芯片對HBx+-HepG2和HBx--HepG2細胞的基因表達譜進行分析后，發(fā)現(xiàn)在檢測的35000個基因中，其中有98個基因轉錄顯著上調(diào)，24個基因轉錄顯著下調(diào)。這些差異顯著的基因屬于不同的類型，不

8、僅包括癌基因及抑癌基因，還有調(diào)節(jié)細胞周期，轉錄調(diào)節(jié)，信號分子，細胞黏附分子及編碼骨架蛋白的基因。有趣的是，對基因芯片分析后發(fā)現(xiàn)HBx能明顯上調(diào)肝癌細胞B7-H1基因轉錄，經(jīng)實時定量PCR進一步驗證，蛋白免疫印跡及流式細胞儀分析表明HBx也促進HepG2細胞B7-H1蛋白的表達。最終確定HBV X蛋白上調(diào)了B7-H1在HepG2細胞中的表達。為進一步驗證HBV X蛋白對共抑制分子B7-H1表達的上調(diào)作用，采用細胞流式技術分析PLC/C4細

9、胞系中共抑制分子B7-H1的表達，同樣得到HBV X蛋白的表達上調(diào)共抑制分子在PLC細胞的表達的結果，而X基因被干擾的C4細胞B7-H1未上調(diào)表達。
　　 那么HBx通過何種機制上調(diào)肝癌細胞B7-H1的表達呢?大量實驗數(shù)據(jù)提示轉錄因子NF-κB在HBx對宿主細胞轉錄激活中發(fā)揮重要作用。HBx通過激活NF-κB途徑而誘導細胞上調(diào)各種基因的表達，如TNF-α、淋巴毒素α，啟動子分析提示B7-H15’啟動子非編碼區(qū)有幾個NF-κB結合

10、位點，有研究表明NF-κB在亞溶破攻膜復合物C5b-9誘導腎小管上皮細胞上B7-H1的表達及IFN-γ誘導皮膚纖維原細胞上的B7-H1表達中起重要作用。本研究我們也試圖確定是否HBx誘導B7-H1的mRNA的轉錄依賴于NF-κB的作用。我們首先PCR擴增B7-H15’啟動子非編碼區(qū)基因片段，并插入到含有熒光素酶報告基因的載體pGL3-Basic中構建重組子，經(jīng)雙酶切和測序鑒定后分別命名為p88，p175，p203，p398，p723，p

11、960。將以上重組子分別轉染HBX+-HepG2、HBx--HepG2細胞。熒光素酶活性分析表明與HBx--HepG2細胞相比，轉染HBx+-HepG2細胞48h后B7-H1啟動子上游2405bp至175bp區(qū)域熒光素酶的活性明顯升高。然而轉染重組子p88后，熒光素酶的活性顯著下降。通過GenomeNet我們分析B7-H1啟動子上游175bp內(nèi)的轉錄因子結合位點，發(fā)現(xiàn)了一個NF-κB基序結合位點。我們突變了B7-H1啟動子上游175bp

12、內(nèi)NF-κB結合位點，并將該突變的重組子轉染HBx+-HepG2細胞。熒光素酶實驗結果表明轉染含NF-κB突變位點的重組子其B7-H1啟動子活性下降約70-80％。此外，我們分別在HBx--HepG、HBx+-HepG2細胞加入核轉錄因子NF-κB抑制劑PDTC作用24h后，Western-blot分析B7-H1的表達，結果顯示加入PDTC作用24h后HBx+-HepG2細胞表達B7-H1水平顯著下降，以上證實HBx誘導HepG2細胞上

13、B7-H1的表達主要通過NF-κB途徑。
　　 大量研究已證實腫瘤細胞表達的B7-H1促進T細胞的凋亡。為分析HBx誘導表達的B7-H1對T細胞凋亡的影響，我們首先從健康人的外周血分離PBMC，采用磁化細胞分離器分離法分離初始T細胞，用相應的CD3、CD28單抗激活初始T細胞，分別將HBx+-HepG2和HBx--HepG2細胞與活化的T細胞進行共培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后，收集T細胞，annexin-V和PI雙染，流式分析T細胞凋亡率

14、。結果顯示與HBx--HepG2細胞共培養(yǎng)相比，T細胞與HBx+-HepG2共培養(yǎng)后凋亡率明顯增加。有趣的是，在共培養(yǎng)之前加入B7-H1中和性抗體時，T細胞凋亡顯著下降，證實HBx誘導的B7-H1信號促進了共培養(yǎng)系統(tǒng)中T細胞的凋亡。
　　 綜上所述，本研究分析了HBx與B7-H1在肝癌形成中的潛在聯(lián)系，我們利用人的肝細胞癌細胞株HepG2細胞，轉染含HBx基因的質粒后能穩(wěn)定表達HBx蛋白。基因芯片及定量實時PCR均證實與轉染空載

15、體的HepG2細胞比較，轉染HBx基因的HepG2細胞其B7-H1 mRNA的水平顯著增加。流式與蛋白免疫印跡進一步證實HBx+-HepG2細胞其B7-H1蛋白水平明顯增加。構建含B7-H1啟動子熒光素酶報告基因的質粒，熒光素酶報告系統(tǒng)分析表明B7-H1基因轉錄起始位點上游的128與137 bp之間的NF-κB結合位點可能在HBx誘導B7-H1表達起一定作用，定點突變及阻斷試驗進一步證實了NF-κB在HBx誘導B7-H1表達起主要作用。