抑制性共刺激分子B7-H1與慢性乙型肝炎免疫機(jī)能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、HBV的精確致病機(jī)制尚未完全闡明。但大量研究表明HBV本身并無細(xì)胞毒性，機(jī)體針對(duì)HBV產(chǎn)生的病理性細(xì)胞免疫應(yīng)答是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和CHB的決定因素。機(jī)體的細(xì)胞免疫系統(tǒng)包括組織相容性復(fù)合物-Ⅱ類(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)分子限制的CD4+T輔助細(xì)胞(Thelpercells，Th)細(xì)胞和MHC-Ⅰ類分子限制的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CytotoxicTLymphocytes，CTL)。CD4+T

2、h細(xì)胞根據(jù)分泌細(xì)胞因子譜不同可分為：(1)Th1細(xì)胞(可分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α)；(2)Th2細(xì)胞(可分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13)。IL-10是體內(nèi)最重要的抗炎性細(xì)胞因子之一。在人體和小鼠上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其有較強(qiáng)的抑制Th1細(xì)胞活性和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的作用[7，8]。Th1細(xì)胞因子可通過增強(qiáng)CTL的殺傷效能和非細(xì)胞毒性清除機(jī)制發(fā)揮抗病毒作用，但同時(shí)有加劇肝臟炎癥活動(dòng)和肝細(xì)胞損傷的不良效應(yīng)；Th2細(xì)胞

3、因子可平衡或消減Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。如此雖然可以減弱針對(duì)HBV的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而減輕肝細(xì)胞損傷，但另一方面卻不利于HBV的清除，易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HBV的免疫耐受。因此，Th1/Th2細(xì)胞因子平衡對(duì)機(jī)體有效發(fā)揮抗病毒的免疫應(yīng)答有重要作用。成熟的CD8+CTL細(xì)胞除可分泌穿孔素和顆粒酶直接殺傷靶細(xì)胞外，還可表達(dá)Fas配體等表面分子和分泌IFN-γ、TNF-α、TNF-β多種可溶性細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng)。Fas配體的表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡至關(guān)

4、重要。急性自限性乙型肝炎時(shí)機(jī)體可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的多克隆的針對(duì)HBV各種抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，相反，慢性HBV感染時(shí)機(jī)體免疫狀況的研究發(fā)現(xiàn)有CTL反應(yīng)的嚴(yán)重缺陷以及IL-10水平增高為特征的Th2細(xì)胞反應(yīng)占主導(dǎo)的Th1/Th2細(xì)胞因子失衡存在。因此，研究CTL功能缺陷和Th2細(xì)胞反應(yīng)占主導(dǎo)的Th1/Th2細(xì)胞因子失衡的機(jī)制是揭開HBV慢性感染之謎的重要線索。 效應(yīng)細(xì)胞CD4+Th細(xì)胞和CD8+CTL細(xì)胞的活化依賴抗原遞呈細(xì)胞(anti

5、gen-presentingcell，APC)有效的遞呈非己抗原。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)作為專職抗原遞呈細(xì)胞，能有效活化初始性T細(xì)胞而在激發(fā)特異性免疫應(yīng)答中擔(dān)當(dāng)重要角色。DC激發(fā)抗原特異性T細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號(hào)：第一信號(hào)是由TCR-MHC-抗原肽復(fù)合物傳遞的特異性識(shí)別信號(hào)；第二信號(hào)是由共刺激分子傳遞的非特異性協(xié)同刺激信號(hào)。共刺激分子不僅能提供促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子分泌的正性共刺激信號(hào)，而且能傳遞削弱和終止

6、T細(xì)胞活化、增殖的負(fù)性共刺激信號(hào)，它們?cè)诿庖叻磻?yīng)的不同時(shí)相發(fā)揮各自的作用，從而形成了一個(gè)嚴(yán)密的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的體系。B7-CD28分子家族是一類重要的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的共刺激分子。B7-1和B7-2及其受體CD28/CTLA-4(cytotoxicTlymphocyteantigen-4)代表經(jīng)典的正性或負(fù)性共刺激分子。隨著研究的不斷深入，近年來又發(fā)現(xiàn)了一批新的B7-CD28分子家族成員。B7-H1、B7-DC/PD-1是新近發(fā)現(xiàn)的抑制性共刺

7、激分子通路。在體外B7-H1能優(yōu)先刺激T細(xì)胞分泌大量IL-10，并能負(fù)調(diào)DC功能、抑制活化T細(xì)胞的增殖，B7-DC也具有抑制活化T細(xì)胞增殖的能力。因此，B7-H1、B7-DC/PD-1通路參與維持Th1/Th2細(xì)胞因子平衡。 由于DC在激發(fā)特異性免疫應(yīng)答方面的獨(dú)一無二的角色，因此，慢性乙型肝炎時(shí)的細(xì)胞免疫功能消弱是否由DC功能缺陷引起成了科研人員關(guān)注熱點(diǎn)。在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg)和CHB病人的研究均發(fā)現(xiàn)DC刺激T細(xì)胞增殖能力較

8、正常對(duì)照明顯降低，且DC分泌IL-12水平以及刺激T細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α能力下降，同時(shí)表面MHC-Ⅱ/HLA-Ⅱ、CD80、CD86表達(dá)下調(diào)。因此，慢性HBV感染時(shí)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的削弱與DC功能的缺陷有密切關(guān)系。由于DC發(fā)揮功能依賴其成熟程度及相應(yīng)的共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86和抑制性共刺激分子表達(dá)水平，而B7-H1、B7-DC/PD-1通路參與負(fù)性調(diào)節(jié)DC功能。 由于慢性乙型肝炎主要是由于機(jī)體

9、免疫機(jī)能在多個(gè)方面的缺陷而使機(jī)體不能產(chǎn)生有效的針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的HBV慢性感染，因此，用適當(dāng)方法補(bǔ)償或調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能，使之能激發(fā)有效的針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答，從而可以徹底清除HBV。新型治療性疫苗兼有預(yù)防和免疫治療的作用。負(fù)載抗原的DC具有激發(fā)針對(duì)此抗原的免疫應(yīng)答的作用，因此稱為DC疫苗。由于DC功能缺陷是HBV感染慢性化中有重要原因，故以恢復(fù)DC功能為目標(biāo)的免疫治療也將是一種大有前景的治療手段。體外用HBsAg負(fù)載DC制備

10、DC疫苗可一定程度上激發(fā)針對(duì)HBV的免疫反應(yīng)，但同時(shí)也存在效能不足的問題。 由于B7-H1、B7-DC/PD-1通路參與了Th1/Th2細(xì)胞因子平衡和DC功能的調(diào)節(jié)，而慢性乙型肝炎時(shí)存在Th1/Th2細(xì)胞因子失衡和DC功能缺陷，因此，B7-H1、B7-DC/PD-1通路是否參與了慢性乙型肝炎的發(fā)病值得探討。同時(shí)鑒于B7-H1對(duì)DC功能的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，阻斷B7-H1通路后DC功能增強(qiáng)，我們又研究了B7-H1單抗阻斷后的DC疫苗對(duì)H

11、BVTg小鼠的免疫激發(fā)效果，以期找出能有效提高DC疫苗效能的方法，從而為闡明慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療方法做出了有益的探索。 總之，我們以抑制性共刺激分子B7-H1對(duì)免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)為切入點(diǎn)，從Th2占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2細(xì)胞失衡、DC功能缺陷方面以及增強(qiáng)DC疫苗效能上探討了抑制性共刺激分子B7-H1在慢性乙型肝炎發(fā)病和治療中的作用。 材料與方法第一部分CHB病人：1、分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralb

12、loodmononuclearcell，PBMC)；2、FCM檢測(cè)CD3+T細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞表面B7-H1、B7-DC、PD-1表達(dá)；3、ELISA(enzymelinkedimmunosorbenassay)檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10水平；4、RT-PCR檢測(cè)PBMCB7-H1、IL-10mRNA表達(dá)；5、B7-H1表達(dá)與血清IL-10水平的相關(guān)性分析；6、B7-H1表達(dá)與血清ALT水平

13、的相關(guān)性分析；7、B7-H1表達(dá)與血清HBeAg的相關(guān)性分析。 第二部分HBVTg小鼠：1、脾臟DC制備；2、FCM檢測(cè)DC表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86、B7-H1、B7-DC表達(dá)；3、MLR檢測(cè)DC刺激同種T細(xì)胞增殖能力；4、ELISA檢測(cè)T分泌IL-2、IFN-γ、IL-10水平；5、RT-PCR檢測(cè)肝組織B7-H1mRNA表達(dá)；6、Westernblotting檢測(cè)肝組織B7-H1蛋白表達(dá)。 第三部分HBVD

14、C疫苗：1、MLR檢測(cè)B7-H1/B7-DC對(duì)髓源性DC功能：A組髓源性DC；B組髓源性DC+B7-H1/B7-DC；2、DC疫苗制備：小鼠髓源性DC和純化HBsAg蛋白共孵育；3、疫苗注射：A組：HBsAg疫苗；B組：HBsAg疫苗+完全弗氏佐劑(completeFreundsadjuvant，CFA)；C組：DC疫苗；D組：DC疫苗+B7-H1單抗；E組：PBS陰性對(duì)照；4、疫苗效能檢測(cè)：取小鼠外周血，免疫發(fā)光法檢測(cè)HBsAg、抗-

15、HBsAg水平。 結(jié)果一、CHB病人IL-10增高的Th1/Th2細(xì)胞反應(yīng)失衡與CD14+單核細(xì)胞B7-H1高表達(dá)相關(guān)： 與健康對(duì)照相比1、CHB病人血清IL-2、IFN-γ水平降低而IL-10水平增高；2、CHB病人CD14+單核細(xì)胞高表達(dá)B7-H1，而B7-DC、PD-1表達(dá)無差異；3、CHB病人中CD14+單核細(xì)胞B7-H1高表達(dá)主要見于HBeAg陽(yáng)性病人；4、HBeAg陽(yáng)性病人CD14+單核細(xì)胞高表達(dá)B7-H1與

16、血清IL-10水平呈明顯正相關(guān)；5、HBeAg陽(yáng)性病人CD14+單核細(xì)胞B7-H1高表達(dá)與血清ALT水平呈明顯負(fù)相關(guān)。 二、Tg小鼠脾臟DC功能缺陷與DC下調(diào)表達(dá)MHC-Ⅱ、CD80有關(guān)：與正常同系小鼠相比1、Tg小鼠脾臟DC下調(diào)表達(dá)MHC-Ⅱ、CD80，而CD86、B7-H1、B7-DC表達(dá)無差異；2、Tg小鼠脾臟DC刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力減弱；3、Tg小鼠脾臟T產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、IL-10能力減弱。 三、

17、HBVDC疫苗的效能：1、MLR結(jié)果顯示B7-H1單抗阻斷成熟DC后其活化同種T增殖的能力增強(qiáng)，而B7-DC單抗無此作用；2、各組Tg小鼠血清均無抗-HBsAg產(chǎn)生。 結(jié)論一、CHB病人CD14+單核細(xì)胞高表達(dá)B7-H1可能是HBV慢性感染時(shí)以IL-10增多為特征Th2反應(yīng)增強(qiáng)的原因之一。由此引起的Th2反應(yīng)增強(qiáng)可進(jìn)一步導(dǎo)致針對(duì)HBV的免疫反應(yīng)缺陷，從而使HBV感染慢性化。 二、HBeAg可能是CHB病人CD14+單核細(xì)