PPARα及HNF4α與2型糖尿病及脂肪肝的關(guān)系及羅格列酮的保護(hù)作用.pdf

1、目的：非酒精性脂肪肝fNonalcoholic fattv liver disea-se，NAFLD)發(fā)病率逐年升高，該病常與腹型肥胖、2型糖尿病、高脂血癥同時(shí)存在。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)NAFLD與2型糖尿病、胰島素抵抗密切相關(guān)，胰島素抵抗及2型糖尿病可能是NAFLD形成的啟動(dòng)因素，并且在其形成過(guò)程中可能起中心作用。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome pr01iferator activated receptor α)PPAR

2、α是一種由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員。具有調(diào)節(jié)脂肪代謝和調(diào)節(jié)炎癥、免疫以及細(xì)胞分化等作用，在NAFLD發(fā)病起著很重要的作用。肝細(xì)胞核因子(hepatocyte nuclear facto-4 α，HNF4 α)是高度保守的膽固醇/甲狀腺激素受體超家族成員，在肝臟、腎臟和腸及胰島細(xì)胞中表達(dá)的，其對(duì)NAFLD發(fā)病起著重要的作用，已有的研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠胰島素模型肝臟發(fā)生NAFLD變化，肝臟HNF一4 α mRNA降低

3、，本研究進(jìn)一步探明高脂飲食+小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠肝臟的變化及肝臟HNF-4 α mRNA及PPAR α mRNA表達(dá)的變化。噻唑烷二酮類(lèi)化合物(thiaz01idineline，TzD)是一類(lèi)作用于PPAR γ受體，治療2型糖尿病的新藥，為進(jìn)一步闡明NAFLD的發(fā)病機(jī)制，并尋找和發(fā)現(xiàn)有效防止NAFLD新方法也已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的重要課題。 本研究旨在： 1 通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)+小劑量STZ建立w

4、istar大鼠2型糖尿病動(dòng)物模型，該模型具有腹型肥胖、高血糖、高胰島素血癥、高血脂、胰島素敏感性降低、脂肪肝的特點(diǎn)。 2 探討PPAR α mRNA及HNF4 α mRNA在NAFLD發(fā)生時(shí)在肝臟表達(dá)的變化。 3 噻唑烷二酮類(lèi)(thiazolidinedine，TZD)對(duì)2型糖尿病及NAFLD的干預(yù)作用。 方法：健康Wistar雄性大鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為普通飲食組(正常對(duì)照組A組)15只，和高脂

5、飲食組(實(shí)驗(yàn)組)30只，給予高脂飲食喂養(yǎng)8周，按李光偉HOMA指數(shù)判斷出現(xiàn)胰島素抵抗后，腹腔注射STZ造模。除意外死亡和未成模者外，將剩余成模大鼠隨機(jī)分為2組(每組12只)：2型糖尿病組(B組)，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)；羅格列酮治療組(C組)，高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)羅格列酮3mg/kg/d灌胃給藥。所有大鼠試驗(yàn)期間自由飲水，進(jìn)食。分籠飼養(yǎng)，每籠5只。每組大鼠均于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)量體重、取血。大鼠自試驗(yàn)前一日20：00起禁食，實(shí)驗(yàn)日8：00分別

6、自?xún)?nèi)眥靜脈采血3毫升，分離血清，保存于．20℃用于各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，留取部分肝臟于液氮保存，用于測(cè)PPAR α mRNA及HNF4 α InRNA的表達(dá)，其余用多聚甲醛固定，待光鏡下組織學(xué)檢測(cè)。 1 血糖、胰島素的測(cè)定胰島素用放射免疫法測(cè)定。采用穩(wěn)態(tài)模型fHomeoestasisModel AssementHOMA)及胰島素敏感指數(shù)(InsulinSensicivitv Index，ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗的程度。

7、 2 血脂的測(cè)定甘油三脂(triglyceride TG)總膽固醇(total ch01ester01e，TC)高密度脂蛋白highdensity lipoprotein-ch01esterole HDL-C)比色法測(cè)定，低密度脂蛋白膽固醇(10werdensitylipoprotein．cholesterole，LDL-C)由Friedewald公式(LDL-C=TC-HDL-TG/2.2)求出以(mmol/l計(jì))。Cu<'+>

8、比色法測(cè)定游離脂肪酸(FFAs)含量。 3 肝臟PPAR α mRNA及HNG4 αmRNA表達(dá)的測(cè)定用Trizol Kit提取肝臟組織RNA，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)fRT-PCR)分別擴(kuò)增PPlAR α、HNF4 α和β-actin mRNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、攝片和計(jì)算機(jī)圖像掃描。RT-PCR產(chǎn)物半定量：因β-actin在組織中均勻表達(dá)，PPAR α、HNF4 α基因的表達(dá)水平用靶基因與β-actin的比值表示。

9、 4 肝臟形態(tài)學(xué)檢查常規(guī)方法制備大鼠肝臟光鏡組織切片，進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察。 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組問(wèn)差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析和直線(xiàn)相關(guān)分析作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。檢驗(yàn)的顯著性用P值表示。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。 結(jié)果 1 對(duì)體重的影響實(shí)驗(yàn)初期，大鼠隨機(jī)分組，各組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢?/p>

10、對(duì)照組體重明顯低于模型組及羅格列酮干預(yù)組，有顯著性差異(P<0.05)。羅格列酮干預(yù)組體重與模型組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 2 對(duì)血糖和胰島素的影響STZ造模前各組大鼠空腹血糖無(wú)差別。腹腔注射STZ后，模型組與羅格列酮干預(yù)組血糖明顯高于正常組，有極顯著性差異(P<0.01)。羅格列酮干預(yù)組血糖低于模型組(P<0.01)。模型組胰島素水平明顯高于正常組與羅格列酮干預(yù)組胰島素水平，有極顯著性差異(P<0.01)，正常組胰

11、島素水平較羅格列酮干預(yù)組減低(P<0.05)。 3 對(duì)血脂的影響STZ造模后模型組大鼠的TC、TG及FFA均明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)。羅格列酮干預(yù)組的TC、TG及FFA比模型組明顯降低，但仍高于正常組。 4 肝臟病理變化：肉眼觀(guān)正常對(duì)照組肝臟呈紅褐色，質(zhì)軟，模型組及羅格列酮干預(yù)組均呈淺黃色或土黃色，觸之油膩，切開(kāi)時(shí)有油滴，較粗糙，易碎。HE染色觀(guān)察肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變、點(diǎn)狀壞死、脂肪變性。

12、 5 肝臟PPAR α mRNA及HNF4 α mRNA表達(dá)水平的變化PPAR α mRNA的表達(dá)在模型組表達(dá)減弱，低于對(duì)照組，有顯著差異(P<0.01)，羅格列酮組干預(yù)組高于模型組，差別有顯著性(P<0.01)。模型組肝臟HNF4 α mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差別有顯著性(P<0.01)，羅格列酮干預(yù)組表達(dá)水平高于模型組，差別有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論 1 高脂喂養(yǎng)8周可誘發(fā)大鼠胰島素抵抗，該模型具有空