柿葉總黃酮對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化病變的影響及其機制研究.pdf

1、目的:柿葉總黃酮(PLTF)是從中藥柿葉中提取的有效部位,現(xiàn)代研究表明,柿葉黃酮具有血管擴張(軟化血管)、抗氧化、增強機體免疫、止血、殺菌解熱等多種功效,但是,PLTF對動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成的影響未見報道。本實驗通過建立載脂蛋白E敲除(apoE-/-)小鼠的胸腹主動脈及頭臂干動脈粥樣硬化模型,常規(guī)檢測觀察其對小鼠血脂、MDA含量和SOD活性的影響;運用HE、油紅O染色方法觀察其對實驗小鼠AS斑塊的組織形態(tài)學改變及病變面積的影響;

2、運用免疫組化方法觀察其對實驗小鼠胸腹主動脈病變組織P-Selectin、ICAM-1、VCAM-1以及頭臂干動脈病變組織中α-actin、MMP-9的表達變化的影響,探查PLTF對動脈粥樣硬化的治療作用及其可能作用機制。
　　 方法:
　　 第一部分:柿葉總黃酮對apoE-/-小鼠胸腹主動脈粥樣硬化病變的影響及機制研究
　　 實驗動物共設三組,即(1)正常對照組,選用8周齡雄性C57BL/6正常小鼠8只;(2)模

3、型組,選用8周齡雄性apoE-/-小鼠21只;(3)柿葉總黃酮治療組(簡稱黃酮組),選用8周齡雄性apoE-/-小鼠21只。除正常對照組飼喂普通飼料外,其余兩組均飼喂高脂飼料。所有動物自由飲水,每日灌胃一次,黃酮組給予柿葉總黃酮30mg/kg/day,正常對照組、模型組均給予等量的生理鹽水。連續(xù)飼喂16周,麻醉取血,測定血清中TC、TG、VLDL、MDA含量、總SOD活性;手術(shù)剝離胸腹主動脈近心端組織并切片,HE、油紅O染色觀察AS病變

4、的組織形態(tài)學改變及病變面積;免疫組化法觀察胸腹主動脈病變中P-Selectin、ICAM-1、VCAM-1的表達及分布。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析。
　　 第二部分:柿葉總黃酮對apoE-/-小鼠頭臂干動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及其機制研究
　　 實驗動物共設四組,即:(1)正常對照組,選用8周齡雄性C57BL/6正常小鼠8只;(2)模型組,選用8周齡雄性apoE-/-小鼠28只;

5、(3)柿葉總黃酮治療組(簡稱黃酮組),選用8周齡雄性apoE-/-小鼠24只;(4)辛伐他汀治療組(簡稱他汀組),選用8周齡雄性apoE-/-小鼠24只。除正常對照組飼喂普通飼料外,其余三組均飼喂高脂飼料,所有動物自由飲水,每日灌胃一次,黃酮組給予柿葉總黃酮30mg/kg/day,他汀組給予辛伐他汀30mg/kg/day,正常對照組、模型組均給予等量的生理鹽水。連續(xù)飼喂12周,麻醉取血,測定血清中TC、TG、LDL、VLDL、HDL、M

6、DA含量、總SOD活性;手術(shù)取頭臂干動脈并切片,HE、油紅O染色觀察AS病變的組織形態(tài)學改變及病變面積;彈力纖維染色確定斑塊內(nèi)纖維帽數(shù),免疫組化法檢測頭臂干動脈病變中α-actin、MMP-9的表達及分布。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:柿葉總黃酮對apoE-/-小鼠胸腹主動脈粥樣硬化病變的影響及機制研究
　　 1.PLTF對apoE-/-小鼠血清

7、血脂的影響:模型組小鼠血清TC、TG、VLDL水平明顯高于正常對照組(P＜0.01),但模型組(40.51±3.47、3.81±0.42、1.73±0.19)和黃酮組(35.98±5.29、3.34±0.63、1.52±0.28)之間血脂水平無顯著性差異。
　　 2.PLTF對apoE-/-小鼠血清MDA和SOD的影響:模型組小鼠血清中MDA含量(35.18±3.89)明顯高于黃酮組與正常對照組血清中MDA的含量(24.15+3

8、.18、22.27+2.19)(P＜0.05);黃酮組和模型組之間SOD活(113.3±3.24、120.3±5.72)無顯著性差異。
　　 3.PLTF對apoE-/-小鼠胸腹主動脈AS病變組織形態(tài)的影響:正常對照組小鼠胸腹主動脈內(nèi)膜光滑,無AS病變,模型組小鼠胸腹主動脈內(nèi)膜大多可見體積較大的斑塊形成,斑塊突入管腔導致管腔明顯狹窄,黃酮組小鼠胸腹主動脈AS斑塊面積較小,脂質(zhì)、泡沫細胞沉積血管內(nèi)膜,導致血管內(nèi)膜局部增厚,無明顯管

9、腔狹窄。與模型組比較,黃酮組AS斑塊面積與管腔面積之比明顯降低(分別為0.15±0.03、0.07±0.02),差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 4.PLTF對apoE-/-小鼠AS病變組織中粘附分子表達的影響:與正常對照組相比,模型組主動脈斑塊肩部有廣泛的P-Selectin、ICAM-1和VCAM-1陽性染色顆粒表達(163.08±16.33、155.02±13.98、153.91±9.88),而黃酮組中陽性染色顆粒表達

10、較少(184.56±13.52、170.52±16.20、167.63±12.90),主要表達于血管內(nèi)膜,且模型組病變部位灰度顯著低于黃酮組,差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 第二部分:柿葉總黃酮對apoE-/-小鼠頭臂干動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及其機制研究
　　 1.PLTF對apoE-/-小鼠血脂的影響:與正常對照組TC、LDL、HDL、TG水平比較,模型組TC、LDL水平顯著升高(P＜0.05),HDL水平

11、顯著降低(P＜0.05),TG水平也有升高,但無統(tǒng)計學意義。模型組、黃酮組和他汀組三組之間比較,各指標之間均無顯著性差異。
　　 2.PLTF對apoE-/-小鼠血清MDA和SOD的影響:與模型組MDA含量(23.89±1.62)比較,正常對照組、黃酮組、和他汀組三組血清中MDA含量(18.38±1.60、18.31±1.78、16.76±1.94)明顯降低(P＜0.05),但三組之間無顯著性差異;模型組、黃酮組、他汀組三組比較

12、,血清SOD活性(104.26±11.19、100.15±9.74、102.39±10.15)無顯著性差異。
　　 3.PLTF對apoE-/-小鼠頭臂干動脈.AS病變組織形態(tài)的影響:三組小鼠頭臂干動脈內(nèi)膜均有典型的纖維斑塊或粥樣斑塊等AS病變形成,與模型組比較,黃酮組、他汀組大多AS斑塊體積較小,且斑塊面積與管腔面積之比顯著降低(分別為0.33±0.07、0.12±0.02、0.14±0.04),差異有顯著性(P＜0.05)。

13、
　　 4.PLTF對apoE-/-小鼠頭臂干動脈AS斑塊穩(wěn)定性的影響:模型組頭臂干動脈AS斑塊包埋纖維帽數(shù)高于黃酮組和他汀組,其MMP-9的表達亦高于黃酮組和他汀組(分別為137.79±14.92、155.34±10.67、156.76±12.48),差異有顯著性(P＜0.05);三組中所有不穩(wěn)定斑塊MMP-9的表達明顯高于穩(wěn)定性斑塊(分別為130.03±11.73、162.4±10.26),且差異有極顯著性(P＜0.01)。

14、
　　 結(jié)論:
　　 1.PLTF可在一定程度上抑制apoE-/-小鼠AS病變的產(chǎn)生和發(fā)展,但并不依賴于其對血脂的降低作用。
　　 2.PLTF可顯著對抗小鼠機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用,從而抑制AS病變的發(fā)展,但并不是通過直接增強SOD活性來參與反應性的防御保護機制。
　　 3.PLTF可在一定程度上抑制AS病變組織中粘附分子P-Selectin、ICAM-1、VCAM-1和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達,表明