載脂蛋白C3在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 目前，心血管疾病已成為全球衛(wèi)生保健和衛(wèi)生資源的沉重負(fù)擔(dān)，也是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。而作為這些嚴(yán)重心血管疾病起始病變的動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。免疫炎癥在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，幾乎貫穿于疾病的始終。因此，它的發(fā)生不是簡(jiǎn)單的脂質(zhì)沉積，它的形成應(yīng)該是個(gè)長(zhǎng)期的慢性反應(yīng)過(guò)程。因此有理由相信，發(fā)生AS的前提條件是機(jī)體內(nèi)持續(xù)存在某種慢性刺激。
　　 載脂蛋白C3(APOC3)存在于每一個(gè)人體

2、內(nèi)，分布于TRL(富含甘油三酯脂蛋白)和HDL(高密度脂蛋白)中，進(jìn)餐和疾病狀態(tài)使其在二者間發(fā)生快速交換而致分布改變。血漿中高表達(dá)APOC3除了可引起脂類代謝紊亂，近年來(lái)還作為一個(gè)獨(dú)立的促炎角色被重新認(rèn)識(shí)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，APOC3不僅是冠心病(CHD)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子，而且與2型糖尿病(T2DM)、高血壓、肥胖的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。高表達(dá)這種蛋白的小鼠能引起嚴(yán)重的高甘油三酯血癥(HTG)，在高脂喂養(yǎng)后能誘導(dǎo)嚴(yán)重的肝脂肪變性和胰島素抵抗。在人

3、類，自然發(fā)生的APOC3基因的一個(gè)SNP導(dǎo)致其蛋白表達(dá)明顯降低，與野生型相比，這些人的冠脈鈣化程度、10年CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率明顯降低。APOC3的基因多態(tài)性與心血管疾病的關(guān)系也被關(guān)注了很多年了，依然熱情不減地在各種群體和種族中進(jìn)行著研究。國(guó)外研究最多的是第四外顯子非翻譯區(qū)的C3175G，其次是啟動(dòng)子功能區(qū)的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)：C-482T和T-455C，而我國(guó)研究較多的也是C3175G，對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的報(bào)道較少，對(duì)于與CHD的研究

4、目前僅限于畢楠等報(bào)道的C-482T多態(tài)性一篇，而T-455C與CHD的報(bào)道還是空白。本課題組曾探討過(guò)啟動(dòng)子區(qū)這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其變異等位基因在健康人群中與HTG存在正相關(guān)關(guān)系，但這種關(guān)系未出現(xiàn)在T2DM患者人群中。
　　 基礎(chǔ)研究方面，APOC3刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞可引起PKC-β上調(diào)，NF-κB活化，VCAM-1和ICAM-1上調(diào)；同時(shí)還能引起單核細(xì)胞內(nèi)PKC-α上調(diào)、NF-κB活化、β1-整合素上調(diào)，如此促進(jìn)了單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞

5、聚集并發(fā)生粘附。研究還發(fā)現(xiàn)，APOC3能在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)抑制胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)生胰島素抵抗，同時(shí)抑制NO的釋放，結(jié)果導(dǎo)致血管內(nèi)皮處于緊張狀態(tài)而難以舒張。內(nèi)皮細(xì)胞受損、活化、募集白細(xì)胞進(jìn)而發(fā)生粘附，這是AS發(fā)生的必經(jīng)初始環(huán)節(jié)。但是假如后續(xù)的階段不接著發(fā)生，AS便也不會(huì)進(jìn)展，但實(shí)際情況AS在悄無(wú)聲息地逐漸形成，發(fā)病率居高不下。APOC3對(duì)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附之外的AS發(fā)展過(guò)程中的作用研究，還未見報(bào)道。
　　 目的：
　　 (

6、1)研究APOC3在華東地區(qū)漢族人群CHD患者血清中的表達(dá)水平以及與動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系；
　　 (2)研究APOC3啟動(dòng)子區(qū)T455C和C-482T的基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系；
　　 (3)研究APOC3是否能改變促進(jìn)血小板粘附和白細(xì)胞滲出的JAM-1的表達(dá)；
　　 (4)研究APOC3是否引起TNF-α表達(dá)上調(diào)，TNF-α是否引起JAM-1表達(dá)上調(diào)。
　　 通過(guò)探討APOC3在CHD患者血漿中的表達(dá)水平

7、與動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系、APOC3啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與CHD的關(guān)系以及APOC3在AS形成過(guò)程中與炎性細(xì)胞因子、血小板粘附、緊密連接、細(xì)胞滲出的關(guān)系，以期為心血管疾病的防治提供新的思路。
　　 方法：
　　 (1)20例冠狀動(dòng)脈無(wú)狹窄的心臟病患者及187例冠狀動(dòng)脈有狹窄的心臟病患者，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清總APOC3含量和亞組分TRL-APOC3、HDL-APOC3及各項(xiàng)常規(guī)血脂水平，分析其與冠心病以及動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系

8、。
　　 (2)應(yīng)用TaqManSNP等位基因分型技術(shù)檢測(cè)APOC3T-455C和C-482T位點(diǎn)的基因多態(tài)性，分析與CHD的相關(guān)性。
　　 (3)體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，以APOC3各種濃度進(jìn)行刺激，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)、免疫熒光、免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法從基因到蛋白水平觀察內(nèi)皮細(xì)胞JAM-1的表達(dá)；細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)APOC3是否影響THP-1細(xì)胞與小鼠主動(dòng)脈的粘附率。
　　

9、(4)體外培養(yǎng)HUVEC，分別以APOC3和TNF-α進(jìn)行刺激，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相應(yīng)觀察前者TNF-α表達(dá)變化和后者JAM-1表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)與對(duì)照組相比，CHD組血漿總APOC3水平顯著升高(9.46g/L比7.43g/L)，APOA1和HDL-C濃度則降低(分別為1.22g/L比1.40g/L，1.09g/L比1.24g/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而APOC3亞組成分TR

10、L-APOC3和HDL-APOC3、TG、Tch、LDL-C、APOB，在2組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；按照冠狀動(dòng)脈有無(wú)狹窄進(jìn)行分組，與對(duì)照組相比，AS組血清總APOC3水平較對(duì)照組顯著升高(9.46g/L比7.42g/L)，APOA1和HDL-C濃度則降低(分別為1.23g/L比1.40g/L，1.09g/L比1.24g/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余血漿指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。將冠狀動(dòng)脈狹窄組按照狹

11、窄程度分為3組：狹窄在1％-50％之間，狹窄在51％-75％之間，狹窄>75％，結(jié)果，這3個(gè)有狹窄組均比對(duì)照組總APOC3顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而這3個(gè)狹窄組之間總APOC3水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)APOC3啟動(dòng)子區(qū)T-455C和C-482T基因多態(tài)性在冠心病(CHD)組和對(duì)照組(非冠心病組)的各基因型及等位基因頻率、不同基因型間血脂及載脂蛋白水平、基因型與CHD的相關(guān)性分析、CHD組與對(duì)照組的單體型分析等比較分析

12、中均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而這2位點(diǎn)間呈強(qiáng)連鎖不平衡。
　　 (3)JAM-1定位于內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處；APOC3刺激HUVEC細(xì)胞能上調(diào)JAM-1表達(dá)，同時(shí)呈濃度依賴性；APOC3促進(jìn)單核細(xì)胞向小鼠血管內(nèi)皮的粘附。
　　 (4)APOC3刺激HUVEC細(xì)胞能上調(diào)TNF-α表達(dá)；TNF-α刺激HUVEC細(xì)胞能上調(diào)JAM-1表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)血清總APOC3在血管發(fā)生狹窄的人群中高表達(dá)，而不管