Toll樣受體在載脂蛋白E敲除小鼠狼瘡樣自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制中的系列研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分
　　背景與目的：
　　探討ApoE-/-小鼠是否存在狼瘡樣自身免疫反應(yīng)，并初步探討其與動(dòng)脈粥樣硬化的可能相關(guān)性以及觀(guān)察TLR在A(yíng)poE-/-小鼠脾組織中的表達(dá)特點(diǎn)。
　　方法：
　　本研究包括C57BL/6、Fas基因敲除（Fas-/-）以及載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）三種小鼠，后兩者皆以C57BL/6為背景。Fas-/-小鼠是一種狼瘡小鼠，ApoE-/

2、-小鼠則是一種AS小鼠。ApoE-/-小鼠是實(shí)驗(yàn)組，而B(niǎo)6與Fas-/-小鼠分別為陰性與陽(yáng)性對(duì)照組。每組小鼠雌雄各12只，共包括72只小鼠。ApoE-/-、B6小鼠的月齡為2個(gè)月。Fas-/-小鼠（狼瘡小鼠）月齡為8個(gè)月。普通環(huán)境下，為了誘發(fā)AS,所有小鼠高脂飲食（膽固醇0.25％，脂肪15%）4個(gè)月。處死后，ELISA方法檢測(cè)各組小鼠血清IgG、ANA、抗-dsDNA抗體水平并比較，以明確ApoE-/-小鼠是否存在狼瘡樣的自身免疫，檢

3、測(cè)并比較組間脾的重量、腎小球面積以及腎小球內(nèi)IgG（免疫熒光檢測(cè)）和C3與巨噬細(xì)胞（免疫組化檢測(cè)）的表達(dá)以明確自身免疫復(fù)合物的沉積以及上述器官的損害，也檢測(cè)了血清自身免疫相關(guān)因子IL6的水平；觀(guān)察各組小鼠主動(dòng)脈AS損害程度，以及斑塊內(nèi)IgG、C3、巨噬細(xì)胞與TLR4表達(dá)水平，并對(duì)主動(dòng)脈斑塊覆蓋率以及自身抗體水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，以明確ApoE-/-小鼠AS與自身免疫反應(yīng)的相關(guān)性；檢測(cè)比較各組小鼠脾組織TLRs通路分子以及凋亡相

4、關(guān)分子Bax的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)TLRs在自身免疫反應(yīng)中的可能作用。
　　結(jié)果：
　　1.ApoE-/-組小鼠血清IgG、ANA、抗-dsDNA抗體以及IL6水平、脾的重量、腎小球面積、腎小球內(nèi)IgG和C3的表達(dá)，與B6組比較顯著增加（P均＜0.05），與Fas-/-組比較無(wú)顯著差異（除IL6外）；與雄性ApoE-/-小鼠相比較，雌性脾的重量、腎小球面積、外周血IgG、ANA、抗-dsDNA抗體以及IL6水平、腎小球內(nèi)C3的表達(dá)

5、水平顯著增加（P均＜0.05）；腎小球內(nèi)巨噬細(xì)胞的表達(dá)僅見(jiàn)于A(yíng)poE-/-小鼠，而且無(wú)顯著性別差異，但腎小管巨噬細(xì)胞的表達(dá)僅見(jiàn)于雄性ApoE-/-小鼠；
　　2.ApoE-/-小鼠表現(xiàn)出了AS，而B(niǎo)6與Fas-/-小鼠皆未發(fā)生AS,亞組分析顯示雌性ApoE-/-小鼠AS程度重于雄性（P＜0.05）；AS斑塊內(nèi)，IgG、C3、巨噬細(xì)胞以及TLR4表達(dá)皆陽(yáng)性，雌性比雄性表達(dá)較多的IgG、C3與較少的巨噬細(xì)胞（P均＜0.01）；

6、　　3.ApoE-/-小鼠AS程度與血清ANA、抗-dsDNA抗體水平正相關(guān)（P均＜0.05）；4.脾組織蛋白TLRs分析顯示，ApoE-/-與Fas-/-小鼠脾組織TLR4的表達(dá)水平顯著低于B6小鼠（P均＜0.01），而且ApoE-/-小鼠TLR4的表達(dá)水平也顯著低于Fas-/-小鼠（P均＜0.01），雌性ApoE-/-小鼠TLR4的表達(dá)水平顯著低于雄性（P＜0.01）；ApoE-/-與Fas-/-小鼠TLR7的表達(dá)水平顯著高于B6小

7、鼠（P均＜0.01），而且ApoE-/-小鼠TLR7的表達(dá)水平也顯著高于Fas-/-小鼠（P＜0.01）;ApoE-/-小鼠TLR2與9的表達(dá)水平與B6小鼠無(wú)顯著差異，但TLR9的表達(dá)水平顯著低于Fas-/-小鼠（P＜0.01）。
　　5.ApoE-/-小鼠脾組織TLRs通路分子表達(dá)水平分析：ApoE-/-小鼠MyD88、NF-κB、pp38以及IRF3的表達(dá)水平皆顯著低于B6小鼠（P皆＜0.01），其中MyD88、IRF3以及p

8、p38的水平也顯著低于Fas-/-小鼠（P皆＜0.01），而NF-κB的表達(dá)水平與Fas-/-小鼠的差異不顯著。亞組分析顯示：雌性ApoE-/-小鼠MyD88、NF-κB以及IRF3的表達(dá)水平皆顯著低于雄性（P皆＜0.01）。
　　6.ApoE-/-小鼠脾組織Bax的表達(dá)水平小于B6組（P＜0.01），而與Fas-/-組無(wú)顯著差異；亞組分析顯示雌性ApoE-/-小鼠Bax表達(dá)水平顯著低于雄性ApoE-/-小鼠（P＜0.01），也顯

9、著低于雌性Fas-/-小鼠（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.ApoE-/-小鼠表現(xiàn)出了狼瘡樣的自身免疫反應(yīng)，此自身免疫反應(yīng)與AS有相關(guān)性；
　　2.ApoE-/-小鼠脾組織低表達(dá)的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與自身抗體水平的升高及狼瘡樣自身免疫有關(guān)。此發(fā)現(xiàn)對(duì)于探索ApoE-/-小鼠的自身免疫機(jī)制有重要意義；
　　3.ApoE-/-小鼠脾組織TLR4信號(hào)通路分子表達(dá)、狼瘡樣自身免疫以及AS皆存在性別差異。

10、　　第二部分
　　背景與目的：
　　一、通過(guò)TLR4配體LPS的腹腔注射而引發(fā)TLR4下游信號(hào)分子水平表達(dá)變化，觀(guān)察自身免疫反應(yīng)、AS以及脾組織Bax表達(dá)水平受到的影響；二、通過(guò)在應(yīng)用TLR4配體的同時(shí)加用TLR4信號(hào)通路的抑制劑TAK-242，觀(guān)察脾組織TLR4下游信號(hào)分子水平表達(dá)變化，觀(guān)察自身免疫反應(yīng)、AS以及脾組織Bax表達(dá)水平受到的影響。進(jìn)一步探討TLR4與自身免疫反應(yīng)和AS之間的關(guān)系，并試圖從其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子水平

11、上探討其致病機(jī)制。
　　方法：
　　一、包括48只8周齡ApoE-/-小鼠（雌雄各半），雌雄小鼠皆分為鹽水（NS）組（12只）與LPS組（12只），共計(jì)4組。LPS組的小鼠腹腔注射LPS鹽水溶液（2.5mg/kg，250μg/ml），每周兩次；NS組的小鼠則相應(yīng)的注射等容積的NS。共注射20周（W）的LPS或NS。在實(shí)驗(yàn)的第0、2、4、8、12、16以及20W斷尾取血獲取血清，檢測(cè)每只小鼠血清IgG、抗核抗體（antinuc

12、lear antibody，ANA）以及抗雙鏈DNA(anti-double strain DNA，抗-dsDNA）抗體的水平，并比較組間差異,以了解TLR4配體對(duì)自身抗體水平的影響以及自身抗體水平的動(dòng)態(tài)變化。20W后處死動(dòng)物,檢測(cè)每只小鼠免疫器官脾的重量、觀(guān)察脾內(nèi)TLR4信號(hào)分子以及Bax表達(dá)水平在注射LPS后的變化，了解TLR4信號(hào)通路與凋亡相關(guān)分子Bax的關(guān)系，以及TLR4配體對(duì)它們表達(dá)水平的影響。采用HE染色、免疫組化及免疫熒光

13、方法檢測(cè)腎小球面積、腎小球內(nèi)C3、IgG以及腎內(nèi)巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平，并組間比較，以了解TLR4配體對(duì)免疫復(fù)合物沉積以及其對(duì)組織器官的損傷作用。觀(guān)察脾內(nèi)TLR4信號(hào)分子以及Bax表達(dá)水平在注射LPS后的變化，了解TLR4信號(hào)通路與Bax的關(guān)系，以及TLR4配體對(duì)它們表達(dá)水平的影響，并觀(guān)察LPS對(duì)AS的影響；二、包括18只雄性ApoE-/-小鼠，隨機(jī)分為三組：DMSO組，DMSO＋LPS組以及DMSO＋LPS＋TAK-242組，實(shí)驗(yàn)在第一部

14、分進(jìn)行4周后開(kāi)始，同樣檢測(cè)上述自身抗體、免疫復(fù)合物沉積、AS以及脾組織TLR4銜接分子和Bax等指標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　一、
　　1.注射TLR4配體LPS2W后，雄性ApoE-/-小鼠血清IgG、ANA以及抗-dsDNA抗體水平較NS組持續(xù)升高(P皆＜0.01)；而雌性上述指標(biāo)第4-12W周顯著升高(P皆＜0.05)，以后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至第20W顯著低于NS組（P＜0.01）；
　　2.注射TLR4配體20W后

15、，雄性ApoE-/-小鼠脾、腎重量、腎小球面積、腎小球C3與IgG表達(dá)較NS組顯著增加（P皆＜0.05或0.01），而雌性增加不顯著(除C3外）；
　　3.注射TLR4配體20W后脾組織蛋白檢測(cè)顯示：雄性ApoE-/-小鼠TLR4、MyD88、NF-κB、IRF3、pp38以及Bax表達(dá)水平較NS組顯著下降（P皆＜0.01），而雌性ApoE-/-小鼠顯著增加（P皆＜0.01）；
　　4.注射TLR4配體20W后ApoE-/-

16、小鼠AS程度加重。
　　二、
　　1.實(shí)驗(yàn)的第2W開(kāi)始DMSO＋LPS＋TAK-242組ApoE-/-小鼠血清IgG、ANA以及抗-dsDNA抗體水平持續(xù)顯著低于DMSO＋LPS組（P＜0.01），與DMSO組無(wú)顯著差異；
　　2.實(shí)驗(yàn)第16 W后，DMSO＋LPS＋TAK-242組ApoE-/-小鼠脾、腎重量、腎小球面積、腎小球C3與IgG表達(dá)較DMSO＋LPS組顯著降低（P皆＜0.05或0.01），而與DMSO組無(wú)

17、顯著變化；
　　3.實(shí)驗(yàn)第16 W后，脾組織蛋白檢測(cè)顯示：DMSO＋LPS＋TAK-242組ApoE-/-小鼠TLR4、MyD88、NF-κB、IRF3、pp38以及Bax表達(dá)水平高于DMSO＋LPS組（P皆＜0.01），而與DMSO組無(wú)顯著變化；
　　4.DMSO＋LPS＋TAK-242組AS程度顯著輕于DMSO＋LPS組（P＜0.05），而與DMSO組無(wú)顯著差異。
　　5.DMSO＋LPS＋TAK-242組AS斑塊

18、內(nèi)TLR4表達(dá)水平顯著低于DMSO＋LPS組（P＜0.05），而與DMSO組無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.TLR4配體（LPS）可以加重ApoE-/-小鼠的自身免疫與AS；
　　2.TLR4抑制劑可以顯著減弱LPS對(duì)雄性ApoE-/-小鼠自身免疫與AS的影響；
　　3.TLR4通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax水平而影響ApoE-/-小鼠脾組織細(xì)胞的凋亡，引發(fā)自身抗體水平的變化；
　　4.TLR4可能通過(guò)影響Apo