若干中心代謝途徑單基因敲除對大腸桿菌代謝影響的研究.pdf

1、人類基因組計劃的實行推動了大腸桿菌基因組測序的完成,為大腸桿菌突變菌的構建和代謝研究提供了遺傳學的基礎.本文選取有代表性的中心代謝途徑單基因敲除大腸桿菌進行考察,包括IpdA、poxB、sucA和sucC基因敲除大腸桿菌.其中,前兩個基因編碼連接糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的酶,后兩個基因編碼三羧酸循環(huán)酶.根據(jù)生長特性、基因表達、酶活、胞內(nèi)代謝物濃度以及基于碳13標記實驗的代謝通量分析來考察這些單基因敲除對大腸桿菌代謝的影響. lpd

2、A基因敲除大腸桿菌中丙酮酸脫氫酶復合體和α-酮戊二酸脫氫酶復合體均缺陷,該突變菌株的表型與野生菌有顯著不同.在LB培養(yǎng)基中,利用葡萄糖階段,葡萄糖的利用速率降低,細胞生長緩慢,由于生成大量的丙酮酸,細胞產(chǎn)率非常低;吸收丙酮酸階段,產(chǎn)生D-乳酸、乙酸、琥珀酸和L-谷氨酸.基于酶活和胞內(nèi)代謝物濃度的測量結果,發(fā)現(xiàn)丙酮酸的吸收是丙酮酸氧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸合酶.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶共同作用的結果.通過丙酮酸氧化酶吸收的丙酮酸被轉化成乙酸然

3、后通過乙酰輔酶A合成酶、磷酸乙酰轉移酶-乙酸激酶共同作用生成乙酰輔酶A來支持細胞的生長.lpdA突變菌中積累的丙酮酸在基因表達水平和酶活水平激活了D-乳酸脫氫酶,造成了D-乳酸的積累.三羧酸循環(huán)的中斷激活了乙醛酸途徑.L-谷氨酸在突變菌中的大量積累是由于其前體代謝物α-酮戊二酸的積累造成的. poxB基因敲除降低了大腸桿菌細胞的葡萄糖吸收速率、細胞生長速率和生物量產(chǎn)率,升高了大腸桿菌的氧氣消耗速率和二氧化碳釋放速率.丙酮酸氧化酶

4、的缺失并沒有導致顯著的丙酮酸積累,從這一點我們可以看出,有氧條件下丙酮酸的代謝主要依賴于丙酮酸脫氫酶復合體,而丙酮酸氧化酶并不起決定作用.酶活的測定結果表明丙酮酸氧化酶的缺失導致了中心代謝途徑酶活的改變..poxB突變菌在合成培養(yǎng)基中葡萄糖激酶酶活上升,但是由于其它一些糖酵解酶如6-磷酸果糖激酶和1,6-二磷酸果糖醛縮酶活力的下降導致糖酵解途徑的代謝通量降低.在LB培養(yǎng)基中,三羧酸循環(huán)酶如檸檬酸合酶和蘋果酸脫氫酶在.poxB突變菌中被抑

5、制.丙酮酸氧化酶的缺陷同時也導致了6-磷酸葡萄糖脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶活力的升高.這說明該酶雖然在正常大腸桿菌的代謝中不起決定作用,但還是具有一定的調節(jié)作用.特別是該酶在lpdA突變菌中起著非常重要的作用,如果在lodA突變菌中如果抑制丙酮酸氧化酶,細胞停止生長. sucA和sucC基因位于同一個操縱子.sucABCD,均編碼三羧酸循環(huán)酶.其中sucA參與編碼α-酮戊二酸脫氫酶復合體,sucC參與編碼琥珀酰輔酶A合成酶.雖然.

6、sucA和sucC基因擁有這些相似點,但是這兩個基因的缺失對大腸桿菌代謝的影響卻有很大的差異.實驗結果表明,三羧酸循環(huán)酶的缺陷并不一定都會影響細胞的生長速率..sucA基因的缺失顯著降低了大腸桿菌的生長速率,而sucC基因的缺失并沒有明顯影響細胞的生長速率.sucA突變菌中的α-酮戊二酸脫氫酶復合體的缺失導致了α-酮戊二酸的積累,而在大腸桿菌中α-酮戊二酸是合成谷氨酸的代謝前體,從而導致谷氨酸的積累.盡管.sucC基因編碼的琥珀酰輔酶A

7、合成酶負責催化α-酮戊二酸脫氫酶復合體的下游反應,但是并沒有導致α-酮戊二酸和L-谷氨酸的積累. sucA突變菌的葡萄糖吸收速率降低,乙酸的產(chǎn)量降低,并且能夠吸收利用乙酸.乙酸激酶在 sucA突變菌中活力下降直觀地解釋了該突變菌產(chǎn)生的乙酸量較少的原因,而糖酵解途徑活力的降低揭示了乙酸產(chǎn)生量減少的根本原因是下降的糖酵解途徑的代謝通量.乙醛酸途徑的顯著激活實現(xiàn)了乙酸的再利用.與之相對的是,sucC突變菌的葡萄糖吸收速率與野生菌相比并

8、沒有明顯的變化,sucC突變菌產(chǎn)生非常大量的乙酸但是并不利用產(chǎn)生的乙酸.乙酸激酶在.sucC突變菌中活力上升催化產(chǎn)生的乙酸量大大提高,乙醛酸途徑并沒有因為大量乙酸的生成而被激活,乙酸根本不可能再被吸收利用.連續(xù)發(fā)酵中,全局調控基因fadR和iclR在sucA突變菌中表達水平的降低促進了aceA基因的表達水平的升高導致了乙醛酸途徑的激活,而在.sucC突變菌中表達水平的穩(wěn)定,使得aceA基因的表達水平與野生菌持平.全局調控基因arcA和f

9、nr的基因表達水平在兩個突變菌中的降低,導致一些三羧酸循環(huán)酶的激活. 由于三羧酸循環(huán)被中斷,.sucA和sucC突變菌的氧化還原平衡發(fā)生了變化.還原態(tài)NADH、NADPH的量減少,氧化態(tài)NAD<'+>和NADP<'+>的濃度明顯升高.這兩個突變菌中高能物質ATP濃度均有明顯增加.根據(jù)實驗數(shù)據(jù)推測,對于sucC突變菌,由于乙酸生成途徑是大腸桿菌中產(chǎn)生ATP的重要途徑,大量乙酸的生成同時也生成了大量的ATP.但是對于.sucA突變菌

10、,因為乙酸生成量降低,所以生成大量ATP的主要途徑顯然不是乙酸的生成反應,在該突變菌中,氧化磷酸戊糖途徑的活力明顯升高,而該途徑生成的NADPH可以通過電子傳遞鏈反應生成ATP.所以sucA和 sucC 兩個突變菌雖然表現(xiàn)出來的ATP積累的表型是相同的,但是其代謝的機理卻是截然不同的. 來源于以均勻標記葡萄糖、首位標記葡萄糖和天然葡萄糖的混合物為底物進行的<'13>C標記實驗的<'1>H-<'13>C NMR 和GC-MS信號被

11、用來研究基因敲除對胞內(nèi)代謝通量分布的影響.標記實驗的主要思想是跟蹤來源于底物的標記碳原子,進行基于碳原子同位素的平衡計算.已知底物分子的同位素標記狀態(tài)和代謝反應網(wǎng)絡,根據(jù)同位素的平衡,給出一組代謝通量就能夠確定中心代謝網(wǎng)絡中的中間代謝物的同位素分子的分布,也就是說一組中間代謝物的同位素分子的分布對應著一組代謝通量.由于氨基酸的同位素分子分布可以從他們相對應的前體(中間代謝物)的同位素分子分布推斷出來,而前體分子的標記狀態(tài)是與代謝通量密切

12、相關的,這樣氨基酸的同位素分子分布就可以與代謝通量相關聯(lián).根據(jù)這個原理,模擬氨基酸的NMR和GC-MS信號也與代謝通量相關聯(lián).在NMR和GC-MS信號模擬過程中,要進行三種校正,包括天然同位素豐度校正、非穩(wěn)態(tài)校正和同位素的相位校正.最優(yōu)的代謝通量分布(包括交換系數(shù))是通過最小化NMR 和GC-MS的實驗數(shù)據(jù)和模擬數(shù)據(jù)之間的差別得到.首先利用MATLAB中自帶的基因算法進行全局尋優(yōu),然后用MATLAB中局部尋優(yōu)函數(shù)或二階 Powell收斂