干燥綜合征唇腺cDNA差減文庫的構(gòu)建和異常表達基因的篩選及其功能的初探.pdf

1、通過構(gòu)建干燥綜合征(Sjōgren’s syndrome，SS)患者唇腺組織cDNA差減文庫，篩選SS患者唇腺中異常表達的基因，從中選擇若干可能與SS發(fā)病機制相關(guān)的基因作為研究對象，從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平進行研究，并結(jié)合臨床檢驗指標進行分析，初步探討這些基因在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 研究對象 唇腺組織全部來自2004年9月～2006年4月間在北京協(xié)和醫(yī)院口腔粘膜科接受唇腺活檢的患者。分原發(fā)SS和正常對照兩組，原發(fā)S

2、S的入選標準要符合2002年SS國際分類(診斷)標準，除外同時合并其它結(jié)締組織病的患者。對照組選擇標準是：有口干或眼干主訴，但SFR和眼科濾紙實驗檢測均正常，自身抗體陰性，唇腺病理正常，同時除外合并其它基礎(chǔ)病變。另外還包括部分唇腺囊腫患者或下唇外傷的患者，收集病變組織周圍或清創(chuàng)組織中的正常唇腺作為研究材料，除外伴發(fā)其它全身疾病的患者。兩實驗組間的年齡比較經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異。 所有參與本實驗的患者在進行唇腺活檢前均被告知，活

3、檢取出的唇腺除送病理科行常規(guī)檢查外，還將有部分唇腺樣本用于SS發(fā)病機制的基礎(chǔ)研究，獲得研究對象同意后留取唇腺活檢的部分標本用于本次研究。 詳細記錄參與本實驗患者的臨床資料，包括年齡、性別、SFR、腮腺造影、濾紙實驗、淚膜破裂時間、角膜染色、ANA、抗SSA抗體、抗SSB抗體、RF、免疫球蛋白(Ig)、ESR、唇腺活檢病理等。 方法 1．SS唇腺組織中cDNA差減文庫的構(gòu)建：利用TRIR(Total RNA Iso

4、lation Reagent，ABgene)分別提取SS和正常對照唇腺中總RNA，利用差減PCR試劑盒(Clontech PCR-Select<'TM> cDNA Subtraction Kit，Clontech)進行差減雜交，將雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)入載體，構(gòu)建正、反兩個差減文庫。 2．異常表達基因的篩選：隨機挑選768個克隆與核素([α-<'32>P]-dATP)標記的PCR第二輪產(chǎn)物進行雜交，進行Northern blot驗證，選擇雜

5、交信號Ratio值大于2的克隆進行測序，所用引物為SP6和T7(Seqtlenase V2．OKit，UK)，在ABI377測序儀(美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)單向測序，將得到的序列在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)上進行比對，得到GeneBank號和基因名稱等有關(guān)信息，查閱文獻，選擇與SS發(fā)病可能有關(guān)的基因做為研究的目標基因。 3．目標基因的mRNA定量分析：根據(jù)目標基因的序列設(shè)計特異性引物，同時合成內(nèi)參基

6、因的引物進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳后掃膠進行半定量分析。 4．蛋白質(zhì)表達的免疫組化分析：用中性福爾馬林固定，石蠟包埋的唇腺切片做底物，用山羊抗人MUC5B親合純化多克隆抗體(Santa Cruz)進行免疫組化染色，使用Image-Pro plus5.0病理圖像分析軟件測定視野內(nèi)棕色顆粒沉積的累計光密度，以此代表蛋白表達量。 5．觀測結(jié)果建立Excel數(shù)據(jù)庫，使用SPSS11.0(Statistics Pakag

7、e forSocial Science)軟件進行統(tǒng)計分析，比較SS組和正常對照組間的差異，將目標基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平與臨床檢驗結(jié)果進行相關(guān)性分析，P小于0.05認為具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 1．SS組和正常對照組患者年齡比較，經(jīng)過t檢驗，p>0.05，沒有統(tǒng)計學差異，說明這兩組人群在年齡方面存在可比性。 2．成功構(gòu)建SS唇腺cDNA的差減文庫，隨機挑選768個克隆，經(jīng)Northern blot驗證R

8、atio值大于2的有99個克隆，其中上調(diào)51個，下調(diào)48個，經(jīng)過測序得到63個200-700bp的序列片斷，上網(wǎng)比對，與GenBank已收錄的基因符合率在98％以上。 3．經(jīng)過半定量PCR分析，MUC5B和MUC7基因在兩組間的表達存在顯著性差異，t值分別為2.4和2.3，P值分別0.032和0.021，說明這兩個基因在SS患者唇腺中表達明顯低于正常對照。 4.MLJC5B和MLJC7 mRNA的表達量分別與病程、SFR

9、、Ig γ％、ESR、RF、唇腺中淋巴細胞浸潤灶評分(LFS)、抗SSA抗體滴度進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)SS患者唇腺中這兩個基因表達量與LFS和抗SSA抗體滴度呈顯著負相關(guān)，MLJC5B與這兩個因素的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.387和-0.474，P值分別為0.032和0.013；mJC7與這兩個因素的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.386和-0.595，P值分別為0.032和0.001。多元回歸分析證實這兩個基因表達量只與抗SSA

10、抗體滴度相關(guān)，MUC5B和MUC7的回歸系數(shù)分別為-0.714和-0.708，P值分別為0.001。 5.UC5B免疫組化分析：MUC5B主要分布在腺泡細胞上，導管細胞少量著色，說明該蛋白主要由腺泡細胞表達。SS患者唇腺中MUC5B蛋白的表達明顯低于正常對照。 6.MUC5B蛋白表達量分別與病程、SFR、球蛋白γ％、ESR、RF、唇腺中LFS、抗SSA抗體滴度進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)SS患者唇腺中蛋白表達量與LFS、抗SSA抗

11、體滴度呈顯著負相關(guān)，與MUC5B mRNA表達量呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.3396，-0.546和0.750，P值分別為0.041，0.003和0.000。多元回歸分析證實只有MUC5B mRNA表達水平與蛋白表達水平相關(guān)，回歸系數(shù)別113.664，P值為0.000。 結(jié)論 1.抑制性差減雜交方法可用于風濕病發(fā)病機制的研究，是初步高通量篩選異常表達基因的用力手段。 2.成功構(gòu)建了SS患者唇腺cD

12、NA差減文庫，SS患者唇腺中存在異常表達的基因。利用差減文庫篩選出來的基因部分可能與SS發(fā)病相關(guān)，可以作為目標基因進一步研究。 3.MIJC5B和MIJC7mRNA的表達在SS患者唇腺組織中是明顯低于正常對照。與疾病的活動性無關(guān)，主要與抗SSA抗體滴度相關(guān)，提示自身抗體在其中起主要作用。 4.MUC5B和MUC7的基因表達的變化同步，影響表達變化的因素相同，提示可能是同一機制導致兩種基因表達的變化。 5.MUC5