馬鈴薯塊莖低溫糖化機(jī)理及轉(zhuǎn)化酶抑制子基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，用途廣泛，其加工產(chǎn)品薯片和炸薯?xiàng)l是風(fēng)靡全球的食品。為了抑制常溫貯藏產(chǎn)生的塊莖失水皺縮、病害傳播、發(fā)芽等現(xiàn)象及延長(zhǎng)加工周期，常將馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下。但低溫常使塊莖中的淀粉加速轉(zhuǎn)化為還原糖，高溫油炸加工時(shí)，還原糖與塊莖中游離的氨基酸發(fā)生反應(yīng)，嚴(yán)重影響炸片或炸條的色澤和品質(zhì)。塊莖“低溫糖化”是個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及淀粉—糖代謝的多種路徑，調(diào)節(jié)和反饋因子多，因此“低溫糖化”的機(jī)理研究是馬鈴薯加工品質(zhì)改良的重要

2、基礎(chǔ)工作。本研究擬探索不同溫度貯藏條件下馬鈴薯淀粉—糖代謝的主要酶類與還原糖含量的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系，明確其主要的調(diào)控因子。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合前人的研究結(jié)果，分離克隆淀粉—糖代謝關(guān)鍵酶的調(diào)控基因，并通過轉(zhuǎn)化馬鈴薯進(jìn)行功能驗(yàn)證，以進(jìn)一步揭示馬鈴薯塊莖淀粉—糖代謝的分子機(jī)理，為改良馬鈴薯加工品質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。研究取得的主要結(jié)果如下： 1.以不同貯藏溫度條件下的鄂馬鈴薯1號(hào)(E1)和鄂馬鈴薯3號(hào)(E3)品種為材料，對(duì)貯藏塊莖還原糖、

3、總糖含量及淀粉-糖代謝中酶活性變化規(guī)律進(jìn)行研究，以明確馬鈴薯炸片色澤指數(shù)的主要影響因素。結(jié)果表明，貯藏期間低溫是促進(jìn)塊莖還原糖累積的主要影響因素，還原糖含量與炸片色澤具有極顯著直線正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步分析表明，在4℃貯藏條件下，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)和蔗糖合成酶活性(SuSy)與塊莖還原糖含量呈顯著負(fù)指數(shù)相關(guān)，酸性轉(zhuǎn)化酶(AcidInv)和堿性轉(zhuǎn)化酶(AlkalineInv)

4、活性與塊莖還原糖的積累呈顯著直線正相關(guān)，是淀粉—糖代謝過程中影響塊莖“低溫糖化”的主要因子。 2.轉(zhuǎn)化酶抑制子是一類同源性較低的蛋白質(zhì)家族，通過轉(zhuǎn)化酶抑制子的調(diào)控可能達(dá)到抑制轉(zhuǎn)化酶活性，進(jìn)而調(diào)控還原糖積累的效果。本研究根據(jù)已報(bào)道的煙草轉(zhuǎn)化酶抑制子序列設(shè)計(jì)特異引物，通過RT-PCR法在煙草T1系中成功分離到液泡轉(zhuǎn)化酶抑制子基因Nt-inhh全長(zhǎng)cDNA。序列分析表明，該基因編碼區(qū)與報(bào)道的Nt-inhh基因完全一致。通過構(gòu)建35S和

5、塊莖特異的patatin啟動(dòng)子調(diào)控下含有Nt-inhh基因cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯。分析轉(zhuǎn)基因植株塊莖在4℃和20℃貯藏一個(gè)月后還原糖含量與液泡酸性轉(zhuǎn)化酶活性表明，Ⅵ活性下降幅度為22.7％(株系A(chǔ)-3)至78.7％(株系B-13)，還原糖下降幅度為20％(株系A(chǔ)-17)至80.5(株系A(chǔ)-30)，說明Nt-inhhcDNA在馬鈴薯中的表達(dá)成功抑制了液泡酸性轉(zhuǎn)化酶的活性，導(dǎo)致還原糖含量降低。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步證實(shí)了低溫貯藏塊莖液泡酸性轉(zhuǎn)化

6、酶活性與還原糖含量呈正相關(guān)關(guān)系。 3.轉(zhuǎn)化酶抑制子是高等植物普遍存在的一類蛋白質(zhì)家族，本研究用RT-PCR結(jié)合5，RACE方法從馬鈴薯栽培種JH塊莖中克隆了轉(zhuǎn)化酶抑制子St-inhcDNA。序列分析表明，St-inh基因編碼區(qū)全長(zhǎng)663bp，編碼221個(gè)氨基酸。將St-inh基因克隆到pET28a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)?；虮磉_(dá)產(chǎn)物與馬鈴薯栽培品種(系)E1、JH試管塊莖以及番茄果實(shí)的轉(zhuǎn)化酶提取

7、物共孵育結(jié)果顯示，其轉(zhuǎn)化酶活性分別下降了34.3％、21％和33.8％。表達(dá)產(chǎn)物與E3葉片Ⅵ和CWI提取物反應(yīng)顯示，隨著表達(dá)產(chǎn)物量的增加，抑制作用加強(qiáng)，說明St-inh的翻譯產(chǎn)物具有轉(zhuǎn)化酶抑制子功能。T-COFFEE氨基酸序列對(duì)比分析顯示，St-inh與Kunitz-typeC類基因序列同源性達(dá)95％以上，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的Kunitz-type結(jié)構(gòu)域[L，I，V，M]-X-D-X-[E，D，N，T，Y]-[D，G]-[R，K

8、，H，D，E，N，Q]-X-[L，I，V，M]-X(5)-Y-X-[L，I，V，M]，因此St-inh基因可能為Kunitz-type家族成員。氨基酸序列Clustalw分析表明，St-inh與Ara-inh、Nt-inhh、Nt-inh、To-inh、Pa-inh、Ip-inh、Ci-inh以及Zm-inh的同源性為14.2～21.0％，說明轉(zhuǎn)化酶抑制子是一類同源性較低的蛋白質(zhì)家族，所克隆的St-inh是一個(gè)新的來自馬鈴薯的轉(zhuǎn)化酶抑制

9、子基因。 4.從鄂馬鈴薯3號(hào)試管塊莖DNA中分離了低溫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子LTP，構(gòu)建35S和LTP驅(qū)動(dòng)的正義St-inh基因的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化鄂馬鈴薯3號(hào)，PCR、Northern雜交檢測(cè)表明已經(jīng)成功獲得表達(dá)St-inhcDNA的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株塊莖4℃和20℃貯藏一個(gè)月后，塊莖還原糖含量降幅最大的達(dá)80.3％(E-1)，Ⅵ下降幅度最大的達(dá)54.2％(D-7)。4℃時(shí)，與對(duì)照比較，所檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株平均還原糖含量下降21.0％，Ⅵ

10、活性下降19.0％，Ⅵ活性與還原糖含量存在明顯的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)化酶是塊莖“低溫糖化”的主要因素之一，通過調(diào)控轉(zhuǎn)化酶抑制子的表達(dá)可有效調(diào)控轉(zhuǎn)化酶活性和還原糖積累。進(jìn)一步的Northern雜交分析表明，與非轉(zhuǎn)基因株系比較，由于正義St-inh基因的轉(zhuǎn)入，St-inh表達(dá)量明顯增加，且低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的St-inh在低溫貯藏塊莖中的表達(dá)顯著提高，但所使用的啟動(dòng)子對(duì)塊莖還原糖積累的抑制作用影響不大，說明組成型或誘導(dǎo)型的St-inh基