馬鈴薯野生種Solanum berthaultii抗低溫糖化基因的分離及表達(dá)特征分析.pdf

1、為實(shí)現(xiàn)馬鈴薯全年供應(yīng)，同時(shí)減少采后病蟲害、塊莖萌發(fā)和失水等帶來(lái)的損失，用于加工的馬鈴薯通常需要儲(chǔ)藏在4℃左右的低溫環(huán)境中，但這樣又帶來(lái)另一個(gè)嚴(yán)重的負(fù)面影響-低溫糖化(Cold-induced sweetening，CIS)，即塊莖低溫儲(chǔ)藏過(guò)程中，易發(fā)生糖化，出現(xiàn)淀粉含量下降、還原糖積累的現(xiàn)象。發(fā)生糖化的塊莖在油炸加工過(guò)程中，還原糖和游離氨基酸發(fā)生Maillard反應(yīng)，以致出現(xiàn)褐色變化、口感變差，并產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的致癌物質(zhì)丙烯酰胺，嚴(yán)重

2、降低了加工產(chǎn)品的品質(zhì)，給馬鈴薯種植業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。馬鈴薯品種改良是控制這一危害的重要途徑。
　　 不同馬鈴薯基因型發(fā)生低溫糖化的程度具有差異，特別是一些野生種，具有較強(qiáng)的抗低溫糖化的能力。因此，了解馬鈴薯低溫糖化的調(diào)節(jié)機(jī)制和發(fā)掘低溫糖化的關(guān)鍵基因，對(duì)馬鈴薯加工品質(zhì)的改良具有重要意義。
　　 本研究選用抗低溫糖化的野生種Solanum berthaultii(accession CW2-1，ber)和不抗低溫糖化的栽培

3、品種(S.tuberosum)鄂馬鈴薯3號(hào)(E3)為材料，篩選塊莖低溫應(yīng)答基因，進(jìn)而通過(guò)在不同抗性材料中的基因表達(dá)譜分析，獲得與低溫糖化相關(guān)的基因。研究取得的主要結(jié)果如下：
　　 1.不同抗低溫糖化馬鈴薯的炸片色澤指數(shù)和可溶性糖含量對(duì)低溫的響應(yīng)
　　 為評(píng)價(jià)儲(chǔ)藏溫度對(duì)不同塊莖炸片色澤、還原糖以及蔗糖含量的影響，本研究分別分析了馬鈴薯ber和E3塊莖在4℃和20℃儲(chǔ)藏0、3、5、10、15、20、30、45、60、75和9

4、0d時(shí)相關(guān)指標(biāo)的變化情況。結(jié)果表明，在20℃儲(chǔ)藏時(shí)塊莖炸片色澤和糖含量變化較小?？傮w來(lái)說(shuō)，低溫儲(chǔ)藏時(shí)，塊莖還原糖和蔗糖含量隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，盡管在儲(chǔ)藏后期有小幅下降，但ber塊莖的還原糖含量明顯低于E3塊莖，蔗糖含量則高于E3塊莖，而且還原糖含量和炸片色澤之間呈顯著線性正相關(guān)。表明野生種ber相對(duì)于栽培種E3而言具有較高的抗低溫糖化能力。
　　 2.反向差減雜交文庫(kù)的構(gòu)建
　　 為進(jìn)一步分析ber低溫反應(yīng)及抗低

5、溫糖化的機(jī)理，本研究在楊建文(2005)構(gòu)建的ber正向低溫差減雜交文庫(kù)的基礎(chǔ)上，分別以4℃和20℃儲(chǔ)藏5d的ber塊莖為Driver和Tester，構(gòu)建反向差減雜交文庫(kù)。在經(jīng)過(guò)兩輪差減雜交和選擇性PCR擴(kuò)增之后，將獲得的差減雜交產(chǎn)物連入pBlueScript SK(-)，通過(guò)Amp/X-gal/IPTG篩選獲得1920個(gè)白色單斑，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步PCR擴(kuò)增篩選，最終獲得由1584個(gè)有效克隆構(gòu)成的反向SSH文庫(kù)，克隆中的插入片段長(zhǎng)度約為500

6、bp。
　　 3.ber塊莖低溫反應(yīng)基因的確定
　　 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得ber正向文庫(kù)中2112條插入序列和反向文庫(kù)中1584條插入序列，純化后定量，作為點(diǎn)制芯片的探針。提取ber塊莖4℃和20℃儲(chǔ)藏5d后的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄時(shí)分別用Cy5和Cy3進(jìn)行標(biāo)記，并與cDNA芯片進(jìn)行雜交，共獲得736個(gè)差異表達(dá)基因，其中663個(gè)上調(diào)，73個(gè)下調(diào)。差異表達(dá)基因序列分析時(shí)共有719個(gè)克隆獲得良好測(cè)序結(jié)果。經(jīng)序列比對(duì)、合并重復(fù)后，共獲

7、得188個(gè)代表不同基因的非重復(fù)序列片段，其中上調(diào)表達(dá)序列138個(gè)，下調(diào)表達(dá)序列50個(gè)。經(jīng)分析，149個(gè)已知功能的差異表達(dá)基因可被歸為14種功能類型，主要與細(xì)胞自救與防御、代謝、能量、蛋白命運(yùn)等細(xì)胞過(guò)程相關(guān)。本研究首次對(duì)馬鈴薯低溫響應(yīng)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為進(jìn)一步研究低溫糖化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.塊莖低溫糖化相關(guān)基因的篩選
　　 以抗低溫糖化的ber塊莖和易低溫糖化的E3塊莖為材料，通過(guò)qRT-PCR方法全面

8、分析上述188個(gè)差異表達(dá)基因在4℃和20℃儲(chǔ)藏時(shí)動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。結(jié)果表明，這些基因中的絕大部分在兩種塊莖中表現(xiàn)出相同的調(diào)節(jié)模式，反映了不同基因型塊莖低溫應(yīng)答機(jī)制具有同一性；但是仍有一些基因的表達(dá)模式或轉(zhuǎn)錄水平在兩種基因型塊莖中存在較大差異，初步推測(cè)這些“特異表達(dá)基因”的表達(dá)強(qiáng)弱，決定了不同基因型塊莖間低溫糖化水平的差異。例如，低溫儲(chǔ)藏時(shí)，ber C20-3-014(GWD)和C20-6-K02(木糖異構(gòu)酶)基因的轉(zhuǎn)錄被抑制，而E3塊莖則為

9、上調(diào)表達(dá)，并且表達(dá)量均高于ber塊莖；ber和E3塊莖C20-2-D03(BMY7)和C20-4-C15(InvInh)基因具有明顯的低溫誘導(dǎo)特性，但ber BMY7轉(zhuǎn)錄水平低于E3，而ber InvInh則高于E3；另外，低溫下ber和E3塊莖C20-6-F06(GAPDH)和C20-3-A14(丙酮酸激酶)基因都呈先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式，但這兩個(gè)基因在ber塊莖中的累積量始終高于E3塊莖。因此，與E3塊莖相比，ber低溫儲(chǔ)藏時(shí)很可能