中國葡萄屬野生種抗白粉病基因原核表達(dá)與抗體制備.pdf

1、　　芪合成酶(STS)是催化植物體內(nèi)芪類化合物合成的關(guān)鍵酶，乙醛脫氫酶(ALDH)是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的一類酶，參與體內(nèi)多種代謝途徑，目前它在植物抗病反應(yīng)中的作用還有待進(jìn)一步了解。本實(shí)驗(yàn)室研究人員通過mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)及cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)，從高抗白粉病的華東葡萄白河-35-1中克隆分離得到中國野生葡萄STS基因、ALDH基因。本研究利用所獲基因通過構(gòu)建該基因原核表達(dá)載體，試圖從體外表

2、達(dá)途徑對該基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證，為該基因在基因工程上的進(jìn)一步應(yīng)用和研究提供依據(jù)，主要取得以下結(jié)果： 1.根據(jù)已獲STS基因、ALDH基因cDNA全長序列，分別設(shè)計(jì)一對特異性PCR引物，以華東葡萄白河-35-1的5’RACEcDNA第一鏈為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，分別獲得大小約1200bp和1600bp的DNA片段，經(jīng)過克隆測序。 2.將ALDH基因定向克隆到原核表達(dá)載體上pGEX-4T-1上，重組表達(dá)載體pGEX-ALDH同樣

3、經(jīng)BamHI和SmaI雙酶切處理，切下片段與已知ALDH基因片段大小一致，證明ALDH基因正確連接到表達(dá)載體上，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將重組表達(dá)載體pGEX-ALDH轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coliBL21中，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，未見有明顯特異性表達(dá)。 3.將STS基因從定向克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，重組表達(dá)載體pGEX-STS同樣經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切處理，切下片段與已知STS基因片段大小一致，證明STS基因正確連接到表達(dá)

4、載體上，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。 4.GST-STS融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，通過高濃度變性劑溶解包涵體和低濃度變性劑梯度透析對該包涵體進(jìn)行了復(fù)性。復(fù)性的蛋白可通過GST親和介質(zhì)進(jìn)行富集、純化，為進(jìn)一步研究基因的功能提供了依據(jù)。 5.以GST-STS融合蛋白包涵體作為抗原免疫家兔，獲得的多克隆抗血清按1：3000稀釋后，經(jīng)Westernblotting檢測對目的蛋白特異性良好，能夠與復(fù)性、純化的GST-STS融合蛋白產(chǎn)