中國(guó)華東葡萄抗白粉病新基因原核表達(dá)與抗體制備.pdf

1、葡萄白粉病是由葡萄白粉病菌[Uncinulanecator(Schw.)Burr.]引起的一種世界性的真菌病害。中國(guó)是葡萄屬植物最重要的原產(chǎn)地之一，中國(guó)野生葡萄蘊(yùn)藏豐富的抗病種質(zhì)資源。本實(shí)驗(yàn)室研究人員通過mRNA差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplayreversetranscription-PCR，DDRT-PCR)及cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RapidamplificationofcDNAends，RACE)，從

2、高抗白粉病的華東葡萄白河-35-1(Vitispseudoreticulata)中克隆分離得到一條抗白粉病相關(guān)的新基因GLOXrg的cDNA全長(zhǎng)序列。 本研究利用生物信息學(xué)的常用工具及軟件初步分析預(yù)測(cè)了該基因編碼蛋白的功能及理化性質(zhì)，將該新基因構(gòu)建原核融合表達(dá)載體，運(yùn)用體外表達(dá)技術(shù)獲得其體外表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了純化研究，為該基因體外功能的進(jìn)一步驗(yàn)證提供依據(jù)。同時(shí)將獲得的融合蛋白作抗原制備多克隆抗體，為目的基因產(chǎn)物在植株

3、體內(nèi)的定位研究、表達(dá)量的時(shí)空變化研究以及轉(zhuǎn)基因植物的篩選和檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。取得的主要結(jié)果如下： 1新基因GLOXrg編碼蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)與功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其可能是一個(gè)定位于細(xì)胞膜上的催化醛類的氧化而產(chǎn)生H2O2的乙二醛氧化酶，但其編碼蛋白的分子量56kDa比已知真菌上乙二醛氧化酶分子量68kDa小。通過對(duì)H2O2抗病作用的分析，GLOXrg基因可能在葡萄抗白粉病的過程中起著重要的作用。 2根據(jù)已知中國(guó)野生葡萄抗白粉病相

4、關(guān)新基因GLOXrg基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異PCR引物，通過PCR方法，以華東葡萄白河-35-1(V.pseudoreticulata)5'RACEcDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增出一條約1572bp的DNA條帶，經(jīng)克隆測(cè)序，結(jié)果顯示所獲片段含有實(shí)際大小為1572bp的完整閱讀框，與已知中國(guó)野生葡萄GLOXrg基因序列完全一致。將目的基因分別構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pGEX-GLOXrg，經(jīng)雙酶切鑒定，目的基因與表達(dá)載體均正確連接，重組表達(dá)載體構(gòu)建

5、成功。 3重組原核表達(dá)載體pGEX-GLOXrg轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(codenplus)中，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，重組菌特異性表達(dá)了在SDS-PAGE上顯示大小為83kDa的融合蛋白，說明GLOXrg基因全長(zhǎng)在E.coliBL21(codenplus)中得到表達(dá)。通過誘導(dǎo)劑IPTG不同濃度誘導(dǎo)對(duì)照、不同誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)照以及不同誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對(duì)照，確定了最佳表達(dá)條件(37℃，0.1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h)。 4以包涵

6、體形式表達(dá)的GST-GLOXrg融合蛋白能夠通過變性溶解、梯度透析方法復(fù)性，復(fù)性蛋白經(jīng)GST親和介質(zhì)進(jìn)行富集，SDS-PAGE結(jié)果顯示獲得了很好的純化蛋白，間接證明目的蛋白經(jīng)重折疊后已恢復(fù)或接近天然結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步的功能驗(yàn)證等研究提供了依據(jù)。 5.以GS-GLOXrg融合蛋白作為抗原免疫家兔，獲得的多克隆抗血清按1：10000稀釋后，經(jīng)Westernblotting檢測(cè)對(duì)目的蛋白特異性良好，能夠與GS-GLOXrg融合蛋白產(chǎn)生抗原