中國野生華東葡萄泛素連接酶基因VpRH2抗白粉病功能研究.pdf

1、歐洲葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上主要的栽培種，但是對白粉病抗性差;葡萄白粉病是嚴重影響歐洲葡萄生長發(fā)育和經(jīng)濟價值的主要因素之一。本研究課題組前期根據(jù)白河-35-1高抗白粉病的特性，接種白粉菌構(gòu)建了cDNA文庫。本研究以cDNA文庫中獲得的EST序列(GR883881)為基礎，克隆了VpRH2的基因全長及其啟動子序列，篩選獲得了VpRH2的互作蛋白VpGRP2A，進行了VpRH2和VpGRP2A的亞細胞定位分析和互作

2、位置分析，將VpRH2在歐洲葡萄無核白中過表達，并進行了抗病性分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)獲得VpRH2基因全長，其開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為1，164bp，編碼387個氨基酸。經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，VpRH2含有RING-H2和跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于ATL家族，與歐洲葡萄ATL20同源，氨基酸同

3、源性為93.02％，其中154位氨基酸殘基的天冬氨酸為插入突變;在葡萄基因組網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)，VpRH2定位在第二條染色體上。
　　2.通過對抗病葡萄白河-35-1和感病品種無核白接種白粉病進行定量PCR分析表明，在抗病葡萄中VpRH2表達量升高，感病葡萄中VvRH2表達量降低。亞細胞定位分析得出VpRH2定位在細胞膜、細胞質(zhì)，在ER、TGN/EE和內(nèi)膜組分中也有分布。ABA處理后，VpRH2的表達表現(xiàn)出下調(diào)趨勢，經(jīng)SA和MeJA處理

4、后表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢。
　　3.根據(jù)公布的葡萄基因組序列同源克隆獲得了VpRH2啟動子序列，脅迫相關(guān)的順式作用元件ABRE、Box-W1、TC-rich repeats、TCA-element和TGACG-element等存在于啟動子的各個區(qū)域，與歐洲葡萄VvRH2啟動子相比，存在較長的3段缺失突變和一段插入突變。將VpRH2和VvRH2的啟動子構(gòu)建GUS融合載體，瞬時轉(zhuǎn)化歐洲葡萄佳利釀葉片，經(jīng)接種白粉菌、噴施MeJA、SA、ABA

5、以及高溫和低溫等不同脅迫處理后進行GUS染色和GUS蛋白定量，分析表明:經(jīng)白粉菌、MeJA和SA誘導處理后，VpRH2啟動子與VvRH2啟動子啟動活性均表現(xiàn)出了增長的趨勢，而VpRH2啟動子受誘導更為顯著;在高溫處理后VpRH2和VvRH2啟動子都表現(xiàn)出了增長的趨勢，但VvRH2啟動子活性高于VpRH2啟動子;兩個啟動子啟動活性在ABA處理后表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢而對低溫脅迫處理不敏感。
　　4.通過酵母雙雜交技術(shù)獲得VpRH2的互作蛋

6、白VpGRP2A(Glycine-rich RNA-binding protein2A)，并通過雙分子熒光互補實驗(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)驗證得出互作發(fā)生在細胞膜和細胞質(zhì)中。VpRH2和VpGRP2A通過26S蛋白酶體途徑降解，但是VpGRP2A的蛋白降解沒有受到VpRH2的明顯促進。VpGRP2A能夠促進VpRH2的表達，同時VpGRP2A的表達受到VpRH2的抑制

7、。
　　5.中國野生華東葡萄VpGRP2A與歐洲葡萄VvGRP2A表現(xiàn)出100％的同源性;通過對抗病葡萄白河-35-1和感病品種無核白接種白粉病進行定量PCR分析表明，VpGRP2A和VvGRP2A表現(xiàn)出相似的表達模式，均為接種白粉病后6～24h內(nèi)表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢，而后趨于穩(wěn)定;VpGRP2A具有細胞核定位，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、TGN/EE和內(nèi)膜組分中也有分布。VpGRP2A在ABA處理后上調(diào)表達，在SA和MeJA處理后表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢。<