番茄SlARF6基因的分離、表達(dá)特征分析及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、生長(zhǎng)素在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。ARF(AuxinResponeFactor)是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，它可以與生長(zhǎng)素反應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的生長(zhǎng)素反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)或是抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。因此研究生長(zhǎng)素反應(yīng)因子對(duì)番茄單性結(jié)實(shí)，改善果實(shí)品質(zhì)具有重要意義。
　　 本研究選用模式植物番茄作為研究對(duì)象，主要研究SlARFs和部分生長(zhǎng)素反應(yīng)基因在番茄坐果與果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)特性，探索了外源激素處理對(duì)SlARFs表

2、達(dá)的影響，構(gòu)建SlARF6的RNAi植物表達(dá)載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因工作，獲得了番茄轉(zhuǎn)基因植株。本研究旨在探討生長(zhǎng)素調(diào)控植物果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)制，為在生產(chǎn)上解決番茄坐果不良等問(wèn)題尋求重要理論依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1)從番茄數(shù)據(jù)庫(kù)中查找到一個(gè)疑似番茄ARF6的EST(ExpressedSequenceTag)片段，在NCBI里BLAST后發(fā)現(xiàn)，此片斷與番茄ARF8有76％的相似性，與擬南芥ARF6有78％的相似性，

3、初步判定此片斷為番茄ARF6。依據(jù)此EST設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并利用同源基因擴(kuò)增的方法成功分離出一條新的番茄ARF的cDNA全長(zhǎng)，命名為SlARF6(SolanumlycopersicumAuxinResponseFactor6，SlARF6)，遞交該序列至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為：HM594684。其cDNA全長(zhǎng)3036bp，最大開(kāi)放閱讀框(Openreadingframe，ORF)2607bp，編碼868個(gè)氨基酸。氨基

4、酸序列分析顯示其有典型的ARF蛋白結(jié)構(gòu)特征，位于N端的DNA結(jié)合域(117-219氨基酸)，位于C端的二聚化區(qū)域(735-817氨基酸)和位于中間的谷氨酸富集區(qū)域(444-557氨基酸)。此外，我們還分離了此基因的DNA全長(zhǎng)5960bp和部分啟動(dòng)子序列1330bp，其DNA序列包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。
　　 2)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)分析SlARFs及生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的時(shí)空表達(dá)表明，SlARF2、SlAR

5、F4、SlARF6、SlARF8、SlARb-7、IAA1、IAA9、GH3和SAUR具有組成型表達(dá)的特點(diǎn)，在不同組織(萼片、花瓣、雄蕊、子房、葉、莖、根)中都可檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本積累。在番茄坐果和果實(shí)發(fā)育前期，SlARF2、SlARF4、SlARF6、SlARF7和SlARF8的表達(dá)隨著花發(fā)育而上升，授粉后降低。如果在開(kāi)花前進(jìn)行去雄處理，SlARF2、SlARF6、SlARF7和SlARF8的表達(dá)仍居高不下，但SlARF4的迅速下降。這證明

6、授粉下調(diào)SlARF2、SlARF6、SlARF7和SlARF8的表達(dá)，這四個(gè)基因與番茄坐果相關(guān)，可能是坐果的負(fù)調(diào)控因子。
　　 3)用外源激素(GA3、IAA、NAA和2，4-D)處理去雄后的番茄子房，刺激子房直接發(fā)育成無(wú)籽果實(shí)。利用QRT-PCR分析比較處理2、4、6天后的子房中SlARF2、SlARF4、SlARF6、SlARF8的表達(dá)變化，結(jié)果顯示SlARF2、SlARF6和SIARF8的表達(dá)下調(diào)，SlARF4的表達(dá)上調(diào)。

7、
　　 4)構(gòu)建了SlARF6的RNAi植物表達(dá)載體。首先克隆得到CaMV35S啟動(dòng)子片斷將其連接入雙元載體pCAMBIA1301，構(gòu)建載體pCAMBIA1301-35S作為空載對(duì)照。然后成功分離SlARF6正義、反義片段，把它們連接到已構(gòu)建好的pCAMBIA1301-35S載體上，最終經(jīng)雙酶切、菌液PCR和測(cè)序多種手段證實(shí)載體構(gòu)建成功，命名為pCAMBIA1301-35S-SlARF6。通過(guò)“凍融法”將pCAMBIA1301-