ICE1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、番茄（LycoperciconesculentumMill）為茄科番茄屬的一年生草本植物，因其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富、美味可口，已成一種世界性蔬菜。低溫一直是限制番茄生長(zhǎng)與分布，影響果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的重要環(huán)境因子。如何提高番茄對(duì)低溫的耐受性一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)?？焖侔l(fā)展的植物基因工程技術(shù)為改善番茄品種的抗寒性提供了新途徑；其中，導(dǎo)入外源基因提高植物抗逆性已成為現(xiàn)代植物育種的主要手段。而植物表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺

2、傳給下一代，同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用的關(guān)鍵。
　　 因此本試驗(yàn)采用PCAMBIA3301植物表達(dá)載體和ICE1基因（cds編碼區(qū)）為基礎(chǔ)，構(gòu)建植物表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，為深入研究ICE1基因在低溫抗性途徑中的功能奠定基礎(chǔ)，并對(duì)深入植物抗寒機(jī)理的研究，有一定的作用。主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）將保存在PMD18-T載體上的ICE1基因cDNA片段用NCOI和BSTEII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％

3、瓊脂糖凝膠電泳后用回收試劑盒回收約1500bp的片段，即目的基因ICE1經(jīng)NCOI、BSTEII酶切得到目的基因ICE1片段和質(zhì)粒P3301，用T4DNA連接酶連接后，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化得到的陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，都得到大小約為1500bp的片段，與目的片段大小吻合，說(shuō)明番茄ICE1基因片段已連接到植物表達(dá)載體P3301上，構(gòu)建了表達(dá)載體P3301-ICE1。
　　 （2）以番茄子葉為外植體，用6-BA

4、與IAA配成9個(gè)激素組合，最終確立一個(gè)較為理想的分化培養(yǎng)基配方：MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+3％蔗糖+0.8％瓊脂，PH5.8。
　　 （3）探索了影響P3301-ICE1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄的若干因素，建立了一個(gè)較為理想的番茄轉(zhuǎn)化體系：子葉在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)48h；侵染時(shí)間為10min；共培養(yǎng)時(shí)間為36h；卡那霉素Kan對(duì)子葉的篩選壓為20mg/L；當(dāng)芽長(zhǎng)到1cm以上時(shí)，將抗性芽切下，轉(zhuǎn)入MS+0.5mg/L