ICE1基因植物表達載體構建及轉化番茄的研究.pdf

1、番茄（LycoperciconesculentumMill）為茄科番茄屬的一年生草本植物，因其果實營養(yǎng)豐富、美味可口，已成一種世界性蔬菜。低溫一直是限制番茄生長與分布，影響果實品質和產量的重要環(huán)境因子。如何提高番茄對低溫的耐受性一直是人們關注的焦點?？焖侔l(fā)展的植物基因工程技術為改善番茄品種的抗寒性提供了新途徑；其中，導入外源基因提高植物抗逆性已成為現代植物育種的主要手段。而植物表達載體的構建是實現外源基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺

2、傳給下一代，同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用的關鍵。
　　 因此本試驗采用PCAMBIA3301植物表達載體和ICE1基因（cds編碼區(qū)）為基礎，構建植物表達載體。利用農桿菌介導法轉化番茄，為深入研究ICE1基因在低溫抗性途徑中的功能奠定基礎，并對深入植物抗寒機理的研究，有一定的作用。主要研究結果如下：
　　 （1）將保存在PMD18-T載體上的ICE1基因cDNA片段用NCOI和BSTEII進行雙酶切，酶切產物經1.0％

3、瓊脂糖凝膠電泳后用回收試劑盒回收約1500bp的片段，即目的基因ICE1經NCOI、BSTEII酶切得到目的基因ICE1片段和質粒P3301，用T4DNA連接酶連接后，用熱激法轉化大腸桿菌DH5a，轉化得到的陽性菌落經PCR擴增和酶切鑒定，都得到大小約為1500bp的片段，與目的片段大小吻合，說明番茄ICE1基因片段已連接到植物表達載體P3301上，構建了表達載體P3301-ICE1。
　　 （2）以番茄子葉為外植體，用6-BA

4、與IAA配成9個激素組合，最終確立一個較為理想的分化培養(yǎng)基配方：MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+3％蔗糖+0.8％瓊脂，PH5.8。
　　 （3）探索了影響P3301-ICE1表達載體轉化番茄的若干因素，建立了一個較為理想的番茄轉化體系：子葉在分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)48h；侵染時間為10min；共培養(yǎng)時間為36h；卡那霉素Kan對子葉的篩選壓為20mg/L；當芽長到1cm以上時，將抗性芽切下，轉入MS+0.5mg/L