番茄生長素應(yīng)答因子ARF1、ARF2基因RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、生長素是一種重要的植物激素，影響植物的生長發(fā)育，包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞伸長和分化、頂端優(yōu)勢、植物向光性、衰老、以及促使某些植物開花、脫落。生長素應(yīng)答因子(ARFs)是一類受生長素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子家族，在生長素信號傳導(dǎo)途徑中起著重要的作用。因此，利用植物基因工程技術(shù)，使生長素應(yīng)答因子ARF1、ARF2基因沉默，觀察其對番茄的生長發(fā)育，特別是果實色素的影響，然后進行功能分析。本研究構(gòu)建番茄生長素應(yīng)答因子．ARF1、ARF2基因的RNA干涉(RNA

2、 intefference,RNAi)植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，獲得有價值的轉(zhuǎn)基因植株，同時，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系進行了優(yōu)化，為生長素應(yīng)答因子的深入研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)番茄生長素應(yīng)答因子同源基因DRl 2<'[59]>的序列，通過Blast比對得到ARF1、2基因的部分cDNA序列，根據(jù)該序列設(shè)計引物，PCR分別成功擴增到長約2Kb的片段，為下一步植物表達(dá)載體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

3、 2．根據(jù)ARF1、2基因的部分cDNA序列，設(shè)計第2對引物，PCR分別成功擴增到長約500bp的片段。得到的ARF1、2基因片段被定向克隆到植物雙元表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒上，構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體pBI121-ARF1、pBI121-ARF2，植物表達(dá)載體pBI121-ARF1、pBI121-ARF2受CaMV35S啟動子調(diào)控，選擇標(biāo)記為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因。 3.以Ac+品種的番茄為材料，對影響農(nóng)桿菌

4、介導(dǎo)番茄轉(zhuǎn)化體系的幾個因素進行了研究。結(jié)果表明，采用濃度為5％的次氯酸鈉溶液對種子進行消毒，既能消毒徹底，又不會延緩種子萌發(fā)時間；播種后不需要進行春化處理。在抗性愈傷組織的篩選中，卡那抗生素的適宜濃度為50mg/L，既能保證理想的愈傷誘導(dǎo)和分化率，又能避免過多的假陽性出現(xiàn)。生根培養(yǎng)基的配方采用MS+500mg/L羧卞青霉素鈉+2mg/L IAA較好，生根時間快，一周之后就可見根出現(xiàn)。經(jīng)過以上幾個因素的分析，大大縮短了番茄轉(zhuǎn)化的周期，且愈