番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體ptom-gfpaada的構(gòu)建

1、1番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadA的構(gòu)建夏蓓蓓夏蓓蓓翟軍鵬翟軍鵬陳吉裕陳吉裕張香琴?gòu)埾闱購(gòu)埮d國(guó)張興國(guó)西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400716摘要：摘要：采用PrimStarHSDNA聚合酶從番茄基因組DNA中擴(kuò)增出了質(zhì)體的trnItrnA基因序列。序列分析結(jié)果表明，所克隆的基因與GenBank公布的序列完全相同，與煙草的trnItrnA基因序列同源性高達(dá)94%。將該片段作為定點(diǎn)整合外源基因的同源重組片段，構(gòu)建成包含Prrn::gfp

2、aadA::TpsbA表達(dá)盒的番茄質(zhì)體定點(diǎn)轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadA，酶切鑒定表明，所構(gòu)建的載體符合預(yù)期設(shè)計(jì)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：番茄；質(zhì)體；trnItrnA基因；載體pTomGFPaadA番茄是世界上重要的蔬菜作物之一。它色澤鮮艷、口感宜人，可鮮食、菜用和加工，能為人們提供多種天然的維生素和礦質(zhì)元素，因而深受消費(fèi)者喜愛[12]。目前，利用基因工程的方法進(jìn)行番茄品種性狀改良的研究取得了很大的進(jìn)展，但多停留對(duì)核基因組的轉(zhuǎn)化，而核基因組轉(zhuǎn)化

3、中存在位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)基因沉默及外源基因表達(dá)量低等問(wèn)題。自從1990年高等植物煙草的葉綠體轉(zhuǎn)化獲得成功以來(lái)[3]，質(zhì)體轉(zhuǎn)化已經(jīng)在許多物種中獲得了成功，且以其獨(dú)特的優(yōu)越性成為植物基因工程的研究熱點(diǎn)，但除煙草以外，其他植物的質(zhì)體轉(zhuǎn)化依然難度較大[4]。質(zhì)體轉(zhuǎn)化通過(guò)同源重組的方式將外源基因定點(diǎn)整合到質(zhì)體基因組上，因此，質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體具有物種專一性。Daniel等利用煙草質(zhì)體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了可用于不同植物的通用質(zhì)體轉(zhuǎn)化載

4、體（universalvect）[5]。目前已有多種作物利用該載體實(shí)現(xiàn)了外源基因在質(zhì)體中的穩(wěn)定表達(dá)[6]，但是轉(zhuǎn)化效率很低[78]?？梢姡鉀Q番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化的難題，構(gòu)建番茄物種專一性的質(zhì)體基因表達(dá)載體非常必要。本研究參照已公布的番茄質(zhì)體的trnItrnA基因序列設(shè)計(jì)引物，從番茄基因組中克隆了trnItrnA基因片段，并以此作為定點(diǎn)整合的同源片段，構(gòu)建了包含GFP基因、選擇標(biāo)記基因aadA及質(zhì)體特異性啟動(dòng)子Prrn和終止子TpsbA的番茄

5、質(zhì)體表達(dá)載體，其結(jié)果對(duì)提高番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化的效率具有重要的利用價(jià)值。1材料和方法材料和方法1.1材料和試劑材料和試劑材料為普通番茄（SolanumlycopersicumL.）品種AilsaCraig。pVCT2161由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。pBio3GFP、大腸桿菌菌株DH5α等由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18T載體購(gòu)自TaKaRa公司。1.2方法方法1.2.1番茄基因組DNA的提取參照CTAB法提取番茄幼嫩葉片中的基因組DNA[9]。1.2.2番茄t

6、rnItrnA基因區(qū)段的克隆根據(jù)番茄質(zhì)體的trnItrnA基因序列（acc#:NC_007898），設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物P1:5’gtattttggtttgacactgcttcacacc3’和P2:5’gtatcggctaagttcacgagttgc3’，分別位于TrnI基因的上游和TrnA基因的下游。以番茄的總DNA為模板，采用PrimStarHSDNA聚合酶（TaKaRaCo.，Japan）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：98℃1min，1

7、個(gè)循環(huán)；98℃10sec，59℃15sec，72℃2min，28個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，再用TaqDNA聚合酶加“A”尾，TA克隆到pMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以P1P2為引物對(duì)菌落進(jìn)行PCR篩選，陽(yáng)性克隆(pMDtrnIA)委托上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（30972008）作者簡(jiǎn)介：夏蓓蓓，1984，女，湖北鐘祥人，碩士研究

8、生，主要從事蔬菜分子生物學(xué)方面的研究。通訊作者：張興國(guó)，研究員。3參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)：[1]王大平.水楊酸對(duì)番茄貯藏品質(zhì)的影響[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)200830(2):7780.[2]王逸群李田.乙肝病毒表面抗原基因?qū)Ψ训倪z傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)200830(7):7883.[3]SvabZHajdukiewiczPMaligaP.Stabletransfmationofplasti

9、dsinhigherplants[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA199087:85268530.[4]MaligaP.Plastidtransfmationinhigherplants[J].Annu.Rev.PlantBiology200455:289313.圖2.2.番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadApTomGFPaadA的構(gòu)建與鑒定的構(gòu)建與鑒定A:番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadA的構(gòu)建

10、流程；B：番茄trnIA基因的PCR擴(kuò)增；C：pKntrnIA質(zhì)粒DNA酶切鑒定；D：pTomGFPaadA質(zhì)粒酶切鑒定；tomtrnI和tomtrnA：用于同源重組的番茄質(zhì)體DNA片段；Prrn：經(jīng)改造的煙草質(zhì)體16SrRNA基因啟動(dòng)子；GFP：綠色熒光蛋白基因；aadA:原核壯觀霉素抗性基因；TpbsA：煙草質(zhì)體pbsA基因終止子；ColEI：大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子；nptⅢ：原核新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Ⅲ；M:λDNAEcⅠHindⅢMa

11、rker；Lane1：trnIA基因的PCR擴(kuò)增；Lane2：pKntrnIA的質(zhì)粒DNA；Lane3：pKntrnIA的EcI和SacI酶切產(chǎn)物；Lane4：pTomGFPaadA[HindIIISacI]酶切；Lane5：pBio3GFP[HindIIISacI]酶切。AseISalI收2633bpAseISalI收2264bp番茄gDNASLtrnISLtrnABstXISacI收2197bpBstXISacI收4742bpM12