柿果實CCD1基因超表達和RNAi載體構建及其農桿菌轉化Micro-Tom番茄的研究.pdf

1、陳昕晟柿果實CCDI基因超表達和RNAi載體構建及其農桿菌轉化番茄的研究摘要與果實品質有重要關系的脫輔基類胡蘿卜素香氣成分形成有關的CCOs(類胡蘿卜素裂解氧化酶)主要是CCDl和CCD4分支，課題組前期研究表明柿果實中確實存在脫輔基類胡蘿卜素香氣成分，但其形成是否與CCDs相關還不確定。根據(jù)已經克隆的DkCCDl基因，本研究構建了含有DkCCDl基因的超表達載體和RNAi表達載體，確定了MicroTom番茄的遺傳轉化體系，并以農桿菌葉

2、盤轉化法將上述兩個載體成功導入番茄中。主要研究結果如下：，1、CTAB法提取‘小方柿’果肉總RNA，根據(jù)帶有不同酶切位點的引物獲得目的基因，將擴增的目的基因序列與NCBI登錄的基因序列進行基因序列比對和氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)基因序列相似度均超過99％，氨基酸序列相似度均為100％，由此得到用于后續(xù)實驗的目的基因；將得到的目的基因與雙元表達載體pCAMBIAl301連接，成功構建了pCAMBIAl301一CCDl超表達載體和具有發(fā)卡結構的p

3、CAMBIAl301CCDlRNAi表達載體，通過凍融法將載體導入農桿菌EHAl05，80。C保存?zhèn)溆谩?、在MicroTom番茄再生體系的基礎上，對載體上所攜帶的標記基因IIygB和篩選過程中的抑菌劑特美汀(Tim)進行壓力篩選。結果發(fā)現(xiàn)，Hyg的濃度越高，對外植體的分化影響越大，愈傷誘導、芽分化和生根篩選培養(yǎng)過程中使用的濃度分別為7mg／L、9mgIL和5mg／L；Tim對外植體的生長沒有較大的抑制作用，濃度為450mg／L時，對愈

4、傷和芽分化有小幅度影響，濃度為500mg甩時，對生根有小幅度影響，結合成本考慮，篩選培養(yǎng)過程中抑菌劑濃度均選擇400mg／L。根據(jù)以上結果確定愈傷誘導選擇培養(yǎng)基為MS2mg幾6BA02m嘰NAA7mgmHyg400mg／LTim07％瓊脂3％蔗糖，芽分化選擇培養(yǎng)基為MS1mg／LZT9mg／LHyg400mg／LTim07％瓊脂3％蔗糖，生根選擇培養(yǎng)基為MS01mg／LNAA5mg／LHyg400mgmTim07％瓊脂3％蔗糖。3、根據(jù)