水稻隱花色素基因（Cryptochrome）RNAi表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化水稻的研究.pdf

1、以載體pSPROK、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301及擬南芥基因內(nèi)含子為材料，通過酶切連接首先構(gòu)建了一個RNAi工程載體pSC1301-347。然而以pSC1301-347為工具，構(gòu)建了有關(guān)水稻隱花色素基因Cry1a、Cry1b和Cry2的四個RNAi和兩個反義RNA表達載體，分別是pSC1301-347-Cry1a、pSC1301-347一Cry2 、pSC1301-347-Cry1ab 、pSC1301-347-Cry

2、1ab2、pSC1301-347-antiCry1a和pSC1301-347-anticry2，其中前四個為RNAi表達載體，最后兩個為反義RNA表達載體。通過農(nóng)桿菌介導法，用這些表達載體分別轉(zhuǎn)化粳稻日本晴水稻，得到200多株不同克隆的Gus陽性植株。經(jīng)測序分析與轉(zhuǎn)基因植株分子檢測證明構(gòu)建的所有表達載體插入序列正確，目的基因片段均已完整地整合于水稻基因組序列。 對T0代轉(zhuǎn)基因植株的觀察分析，初步認為： 1.隱花色素基因?qū)?/p>

3、水稻結(jié)實率影響較大。 從已完成一個生命周期的4個RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)來看，植株均能正常抽穗開花，但基本不結(jié)實。pSC1301-347-Cry1ab2(V3)和pSC1301-347-Cry1ab(V9)未得到一粒種子，結(jié)實率為0；pSC1301-347-Cry1a(V16)和pSC1301-347-Cry2(V19)個別植株得到少量種子。而對照日本晴結(jié)實率可達20％-30％。結(jié)實率低的原因，除冬天氣候因素和轉(zhuǎn)基因當代植株生長較

4、為異常之外，推測是因為隱花色素基因被敲除或抑制后，水稻幼穗分化、減數(shù)分裂、花藥開裂等某個或某些代謝過程發(fā)生障礙，導致最終不能形成正常有活力的雄蕊。 2.子房膨大，不灌漿。 植株開花后，穎花或者空癟，或者子房膨大不灌漿，內(nèi)無淀粉等光合產(chǎn)物積累，只有水狀的液態(tài)物質(zhì)。pSC1301-347-Cry1ab2(V3)和pSC1301-347-Cry1ab(V9)兩個載體的轉(zhuǎn)基因植株尤其如此。推測在兩個及兩個以上的隱花色素基因表達受

5、到抑制時，淀粉的生物合成或運輸途徑出現(xiàn)障礙。 3.花藥不正常。 雄蕊干癟，顏色暗淡，花粉粒很少，不散粉。pSC1301-347-Cry1ab2(V3)和pSC1301-347-Cry1ab(V9)兩個載體的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)尤甚。推測cryptochrome基因可能參與水稻幼穗分化的某個生理生化代謝過程。 4.植株形態(tài)上的差異。 在福州冬季光照不足的玻璃溫室的環(huán)境條件下，pSC1301-347-Crylab2

6、 (V3)和pSC1301-347-Crylab(V9)轉(zhuǎn)基因植株明顯表現(xiàn)出一種病態(tài)：株高比pSC1301-347-Cryla(V16)和pSC1301-347-Cry2(V19)稍高，葉色發(fā)黃枯萎，葉片似長而軟。 5.對開花的影響。 pSC1301-347-Crylab2(V3)和pSC1301-347-Crylab(V9)轉(zhuǎn)基因植株開花時間均比pSC1301-347-Cryla和pSC1301-347-Cry2要遲，

7、因此cry基因與水稻開花有關(guān)，且抑制的基因數(shù)目越多，對開花似影響越大。 以水稻成熟種子和幼嫩種子為材料，對水稻胚性愈傷誘導及其遺傳轉(zhuǎn)化進行了研究。結(jié)果表明，成熟種子、新鮮成熟種子及幼嫩種子愈傷誘導率均>81％，平均86.67％，其中以新鮮成熟種子愈傷率最高，達96.887％；抗性愈傷率成熟胚為22.21％-40.71％，平均28.49％，幼胚為36.79％-43.21％，平均40％，幼胚的抗性愈傷率高于成熟胚；分化出苗率成熟胚為