水稻花發(fā)育關(guān)鍵基因PSD1候選基因的載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化.pdf

1、隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，發(fā)育生物學(xué)已重新成為生物學(xué)中最為活躍的研究領(lǐng)域之一。對雙子葉植物花發(fā)育的研究已取得了重大的進(jìn)展,但對單子葉植物花發(fā)育的研究還相對滯后。通過對水稻花發(fā)育關(guān)鍵基因的克隆研究，將加深我們對單子葉植物花發(fā)育分子遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識。本研究室從水稻秈粳交組合“臺灣粳/圭630”的花藥培養(yǎng)后代(加倍單倍體，DH)群體中發(fā)現(xiàn)了一種雌、雄蕊退化突變體，稱之為pistil-stamen degeneration 1(psd1)。遺

2、傳分析表明，該突變性狀為核內(nèi)單基因隱性突變，并已將該基因精細(xì)定位在水稻2號染色體長臂上一個50 kb的范圍內(nèi)。本論文在此基礎(chǔ)上對該基因的候選基因進(jìn)行推測和功能分析。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： (1)對候選區(qū)域內(nèi)數(shù)個基因進(jìn)行功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域中存在一個MADS基因，在基因組中只有一個拷貝，含有250個氨基酸，為MIKC結(jié)構(gòu)，屬于真核生物Ⅱ型MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族；是AtAGL6的直系同源基因，屬于SEP基因家族的AGL6-l

3、ike亞族：并且在C端結(jié)構(gòu)域存在兩段保守序列，分別是：ECEPTLQIGY和ATSQGAAGGENNFMLGWV。已知植物中許多MADS基因與花發(fā)育有關(guān)。因此我們對突變體psd1中該MADS基因的基因組序列進(jìn)行了分析．結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體中該基因的啟動子和5’端發(fā)生了2915bp的缺失，同時又插入了852k)p。由此看來，psd1突變性狀很可能是由該MADS基因控制的。因此，我們將它確定為候選基因。 (2)為了解候選基因的表達(dá)部位，構(gòu)

4、建了以pCAMBIA1391Z為骨架，由候選基因起始密碼子上游3560bp啟動子驅(qū)動GUS基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)分析載體pCG1，并轉(zhuǎn)化原始野生型(指產(chǎn)生突變體psd1的原始DH株系)和粳稻品種日本晴。pCG1對日本睛的成熟胚誘導(dǎo)愈傷的轉(zhuǎn)化效率很好，獲得了43個抗性愈傷；但對原始野生型的轉(zhuǎn)化效果較低，篩選時愈傷呈現(xiàn)水漬狀，僅得到7個抗性愈傷。 (3)為了解候選MADS基因的過量和異位表達(dá)效應(yīng)，構(gòu)建了以pGA1611和Modified p

5、CAMBlA1301為骨架，由泛素Ubi啟動子和花椰菜病毒的35S啟動子驅(qū)動候選基因ORF轉(zhuǎn)錄的過量表達(dá)載體pGE1和pCE1，并轉(zhuǎn)化原始野生型的成熟胚愈傷。轉(zhuǎn)化后發(fā)現(xiàn)，篩選時愈傷群體也呈現(xiàn)水漬狀，同時較上述生長情況有明顯減緩，其中pGE1轉(zhuǎn)化的尤為明顯。最后僅得到2個pCE1抗性愈傷和1個pGE1抗性愈傷。 (4)為了鑒定候選基因的功能，構(gòu)建了由候選基因起始密碼子上游3560bp啟動子驅(qū)動候選基因自身ORF表達(dá)的功能互補(bǔ)載體p