柑橘生長素響應(yīng)因子ARF基因家族的表達分析及功能驗證.pdf

1、生長素響應(yīng)因子Auxin Response Factors（ARFs）在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵的作用，同時也參與了植物體內(nèi)眾多的生理生化過程。ARFs基因所編碼的蛋白質(zhì)可以與生長素響應(yīng)基因啟動子中特定的響應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)植物的各個生長發(fā)育過程。本文旨在運用分子生物學(xué)手段系統(tǒng)性地分析柑橘中的ARFs基因家族的特征，并對一些關(guān)鍵基因進行功能分析。主要結(jié)果如下:
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)并證實了柑橘（甜橙）中共有19個不同的ARF基

2、因，分別命名為CiARF1-CiARF19。該家族基因編碼的蛋白質(zhì)都具有非常典型的特征，包含三個不同的結(jié)構(gòu)域:分別為氨基末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA BindingDomain，DBD）、中間結(jié)構(gòu)域(Middle Region，MR)、羧基末端的AUX/IAA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C-terminal Domain，CTD）。本研究通過對柑橘中的ARF基因家族進行系統(tǒng)進化分析、染色體定位分析、編碼蛋白的保守motif分析以及基因啟動子區(qū)的順式作用

3、元件分析，從而更加全面地解析了柑橘中ARF基因家族的特征。
　　2.通過定量PCR表達分析發(fā)現(xiàn)，CiARF在甜橙不同的組織和不同的發(fā)育階段，表現(xiàn)出不同的表達模式。一些基因在特定的組織和器官中特異性表達:總體來看，在營養(yǎng)器官中高量表達，在生殖器官中表達量相對較低。同時利用不同濃度的吲哚乙酸（IAA）和萘基鄰氨甲酰苯甲酸(NPA)處理伏令夏橙的愈傷組織，實驗結(jié)果表明，受局部高濃度IAA影響，處理6h后，CiARF1/3/4/6/8/1

4、5/16/17表達量降低，隨后有回升現(xiàn)象。5μmol/L和10μmol/L的NPA處理對CiARFs抑制作用較強。證明不同的CiARF基因?qū)Σ煌瑵舛鹊腎AA和NPA的響應(yīng)程度有所不同。
　　3.探索CRISPR-Cas9系統(tǒng)對CiARF8的修飾情況。構(gòu)建CRISPR-Cas9載體并且轉(zhuǎn)化柑橘愈傷組織。經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織的CiARF8序列與未轉(zhuǎn)化的沒有差別，說明在本試驗中CRISPR-Cas9系統(tǒng)沒有對CiARF8修飾成功。