金魚頭瘤相關(guān)基因差減文庫的構(gòu)建與分析.pdf

1、金魚(goldfish)屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鯽屬(Carassius)，是我國特有的觀賞魚類，起源于晉代的赤鱗魚，經(jīng)過多年的雜交選擇育種后獲得了各種性狀的品種。至今，人們對(duì)金魚的選育仍采用傳統(tǒng)的性狀雜交選擇育種，這種方式能獲得較多觀賞價(jià)值高的品種，但具有隨機(jī)性，且耗時(shí)、耗材和效率低。頭瘤類金魚由于其頭部肉瘤的觀賞價(jià)值而深受喜愛，部分品種頭瘤的組分構(gòu)成及結(jié)構(gòu)已被揭示，但對(duì)頭瘤形成的分子調(diào)

2、控機(jī)制等方面尚不清楚。
　　 本研究以一齡紅獅頭的頭瘤組織作為檢測(cè)子(Tester)，草金和40日齡紅獅頭幼魚的頭頂上皮組織作為驅(qū)動(dòng)子(Diver)，利用消減抑制雜交技術(shù)分別從生長(zhǎng)和進(jìn)化的角度構(gòu)建了2組關(guān)于金魚頭瘤功能基因的差減cDNA文庫。以鯽管家基因a-tubilin為參照，構(gòu)建的cDNA文庫差減效率為210倍。采用特異引物PCR和斑點(diǎn)雜交對(duì)文庫單克隆進(jìn)行篩選、測(cè)序，共獲得有效序列243條，去掉接頭和載體序列后進(jìn)行Blast

3、比對(duì)，取E值小于10-5者為已知基因，共有163條序列具有功能已知的同源基因、35條序列具有功能未知的同源基因和45條序列無比對(duì)結(jié)果（可能為新基因）;利用Blast2go軟件對(duì)所構(gòu)建的文庫序列進(jìn)行GO功能分類注釋，兩組文庫基因的功能主要聚類均為結(jié)合蛋白、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性。
　　 采用Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)GO注釋的基因進(jìn)行功能、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、組織特異性等方面的分析，尋找與頭瘤形成相關(guān)基因。從文庫中篩選出可能與金魚頭瘤形成相關(guān)

4、的基因進(jìn)行了不同組織和不同時(shí)相的表達(dá)分析，以進(jìn)一步鑒定頭瘤功能基因。取紅獅頭成魚的心、肝、脾、腎、鰓、瘤、肌肉、腸、皮等組織，對(duì)待選基因進(jìn)行半定量分析，從中篩選得到5條頭瘤特異表達(dá)的基因序列:Fat2、K18、MAM2、RhoV、PTX3。分別提取2月齡紅獅頭（頭瘤即將生長(zhǎng)）、4月齡紅獅頭（頭瘤剛生長(zhǎng)出來）和一齡紅獅頭（頭瘤發(fā)育完全）3個(gè)時(shí)間段的組織，對(duì)這5條特異基因進(jìn)行不同時(shí)相的定量分析，結(jié)果表明這些基因在頭瘤生長(zhǎng)的過程中呈現(xiàn)出不同的