幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨再生修復(fù)相關(guān)因子的基因克隆與功能研究.pdf

1、研究背景：關(guān)節(jié)損傷后的治療非常困難，是骨科臨床面臨的難題，關(guān)節(jié)損傷后難以修復(fù)及功能恢復(fù)的關(guān)鍵原因是：關(guān)節(jié)軟骨不能很好的修復(fù)，在損傷關(guān)節(jié)軟骨表面尚無有效方法再生透明軟骨層。文獻(xiàn)報(bào)道，幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨損傷后能夠接近完全再生，修復(fù)組織中透明軟骨超過80％，修復(fù)組織的機(jī)械性能和耐久度接近正常的關(guān)節(jié)軟骨，而成年新西蘭白兔在關(guān)節(jié)軟骨損傷部位只能形成纖維瘢痕修復(fù)，修復(fù)組織透明軟骨含量低。這種修復(fù)的差異，推測(cè)是因?yàn)樵趽p傷部位存在著與修復(fù)相關(guān)的基因

2、表達(dá)差異。以具有軟骨再生能力的動(dòng)物為模型，尋找并研究損傷部位局部早期的基因表達(dá)，有可能發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)損傷后再生修復(fù)的重要基因，進(jìn)一步研究目標(biāo)基因的功能，具有重要意義和價(jià)值。
　　 目的：利用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建幼年新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)損傷后修復(fù)組織差異表達(dá)基因文庫(kù)，并通過測(cè)序、生物信息學(xué)檢索篩選膝關(guān)節(jié)損傷后修復(fù)相關(guān)基因，并進(jìn)一步通過RACE 技術(shù)克隆未報(bào)到基因全長(zhǎng)基因序列，進(jìn)行蛋白表達(dá)、純化并初步研究其對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增值及形態(tài)學(xué)的影響。

3、
　　 方法：采用一步法和植物RNA 提取方法相結(jié)合，提取關(guān)節(jié)損傷修復(fù)組織總RNA，應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，篩選幼年新西蘭白兔損傷膝關(guān)節(jié)修復(fù)組織差異表達(dá)基因。選擇具有親子關(guān)系的50周齡成年新西蘭雌性白兔及其子代８周齡幼年新西蘭白兔(雌雄不限)共３對(duì)。在膝關(guān)節(jié)股骨關(guān)節(jié)面背側(cè)用鉆頭制造直徑3mm 深3mm的關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨組織的缺損，取傷后4周損傷部位修復(fù)組織作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。幼年新西蘭白兔的修復(fù)組織為檢測(cè)組(Tester)

4、；成年親代雌性新西蘭白兔的修復(fù)組織為驅(qū)動(dòng)組(Driver)。酶切雙鏈cDNA 成具有平頭末端的小片段，將Tester組平頭末端連接接頭Adaptor1或Adaptor 2R，與酶切后的Driver組進(jìn)行兩次消減雜交和兩輪抑制性擴(kuò)增，產(chǎn)物連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，建立消減cDNA文庫(kù)。PCR 檢驗(yàn)陽(yáng)性插入片斷，每個(gè)陽(yáng)性克隆搖菌擴(kuò)增后送上海生物工程公司測(cè)序。應(yīng)用Chromas 軟件去除測(cè)序結(jié)果

5、中載體序列及插入片斷兩端的接頭序列得到抑制性消減EST 片斷，應(yīng)用DNAStar 5.01對(duì)片斷進(jìn)行重疊群合并及電子拼接，得到差顯基因片斷的序列信息，在GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索，反向Northern 斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證差顯基因片段，選擇有意義的已知基因及未報(bào)到基因片段進(jìn)行后續(xù)功能研究。應(yīng)用RACE 技術(shù)克隆未報(bào)到的10號(hào)和12 號(hào)差異表達(dá)基因片段的全長(zhǎng)基因序列，通過電子拼接獲得電子全長(zhǎng)，并通過高保真酶擴(kuò)增出物理全長(zhǎng)，以pQE3

6、0為載體，構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行蛋白表達(dá)、純化，獲得目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物。抽取成年新西蘭白兔骨髓組織，通過全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化，應(yīng)用MTt技術(shù)檢測(cè)不同濃度梯度的目標(biāo)蛋白對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增值的影響，選擇促進(jìn)增值作用最強(qiáng)的蛋白濃度進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，通過免疫熒光技術(shù)，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，觀察目標(biāo)蛋白對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。研究已知基因VEGF在關(guān)節(jié)損傷修復(fù)過程中的作用。成年新西蘭白兔60只，隨機(jī)

7、分成基因轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組。構(gòu)建AdhVEGF121腺病毒表達(dá)載體，通過無水酒精注射造成股骨頭壞死模型，進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，于損傷后不同時(shí)相點(diǎn)處死動(dòng)物，取壞死區(qū)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨組織，通過RT-PCR 檢測(cè)VEGF在修復(fù)組織中的表達(dá)，通過HE 染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，并對(duì)修復(fù)組織的軟骨下骨進(jìn)行骨密度測(cè)量及骨小梁形態(tài)學(xué)測(cè)量，利用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組的修復(fù)差異。
　　 結(jié)果：一步法結(jié)合植物RNA 提取法

8、提取的總RNA 簡(jiǎn)單快速、純度高、完整性和穩(wěn)定性好，成功逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。應(yīng)用SMART與SSH 相結(jié)合的技術(shù)構(gòu)建了幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)損傷修復(fù)組織差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。藍(lán)白斑篩選獲得223個(gè)陽(yáng)性菌落，隨機(jī)選擇64個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，真陽(yáng)性率超過90％。送217個(gè)測(cè)序，成功測(cè)序199個(gè)。通過軟件拼接得到13個(gè)差異表達(dá)基因序列信息，反向Northern 雜交證實(shí)13個(gè)差顯基因有12個(gè)均在幼年新西蘭白兔修復(fù)組織中高表達(dá)，包括6

9、條線粒體基因、核糖體基因和管家基因。有一條基因表達(dá)無明顯差異。其余6個(gè)基因片斷，有4 條是已知基因片段，分別是A6：XI 型膠原α1鏈，A37：兔皮質(zhì)穩(wěn)定素4，A45：人類PRO1073，A79：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。另外2 條基因，克隆編號(hào)：A78、A80，經(jīng)過檢索未見全長(zhǎng)基因報(bào)到，只有部分序列(CDS)報(bào)道，且在幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)修復(fù)組織中高表達(dá)。差顯基因片斷均在GeneBank 登錄并獲得注冊(cè)。應(yīng)用RACE 技術(shù)成功克隆了未報(bào)

10、到的10號(hào)和12 號(hào)差異表達(dá)基因片段的全長(zhǎng)基因序列，通過電子拼接獲得樂全長(zhǎng)序列信息，在GenBank中獲得注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為FJ571518何FJ571519。.根據(jù)電子全長(zhǎng)設(shè)計(jì)基因特異性引物，通過高保真酶擴(kuò)增出物理全長(zhǎng)，經(jīng)過對(duì)全長(zhǎng)基因序列的同源性檢索，10號(hào)序列與Ⅰ型膠原前α2 鏈有較高的相似性，相似度為99％，Ⅰ型膠原被稱為骨膠原，國(guó)內(nèi)外有大量研究報(bào)道。因此放棄對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究。12 號(hào)基因與人S100A9 有較高相似度，相似率為90％

11、。查閱文獻(xiàn)未見S100A9在關(guān)節(jié)損傷中的報(bào)道。因此對(duì)此基因繼續(xù)后續(xù)研究。利用pQE30載體成功構(gòu)建目的基因原核表達(dá)載體pQE30-12-IGI，通過蛋白表達(dá)、純化，獲得了目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物100微克左右，蛋白為可溶性蛋白。通過全骨髓培養(yǎng)法成功分離純化出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了傳代培養(yǎng)，對(duì)傳代細(xì)胞， MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)12 號(hào)蛋白能夠明顯促進(jìn)充質(zhì)干細(xì)胞增值，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)12 號(hào)蛋白引起間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞骨架增生，細(xì)胞發(fā)生肥大性反應(yīng)。通過

12、RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在目的基因轉(zhuǎn)染組壞死股骨頭關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的修復(fù)組織中VEGF表達(dá)明顯高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染VEGF后，HE 染色提示軟骨下壞死區(qū)新生的骨小梁明顯優(yōu)于對(duì)照組，而在兩個(gè)對(duì)照組，均有不同程度的骨吸收及空隙形成。目的基因轉(zhuǎn)染組的骨密度明顯高于2個(gè)對(duì)照組，骨小梁平均寬度大于對(duì)照組，骨小梁平均間隙小于對(duì)照組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、植物總RNA 提取方法與一步法結(jié)合，簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)，適合提

13、取關(guān)節(jié)軟骨組織小量總RNA。
　　 2、幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)損傷4周后，基因表達(dá)明顯活躍，反向Northen 斑點(diǎn)雜交提示有12個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào)，其中包括與軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的合成及新陳代謝密切相關(guān)的已知差異表達(dá)基因：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、皮質(zhì)穩(wěn)定素4、XI型膠原α1鏈，以及2個(gè)未見全長(zhǎng)基因報(bào)道的基因片斷。進(jìn)一步研究這些差異表達(dá)基因具有重要意義。
　　 3、應(yīng)用RACE 技術(shù)成功克隆出A78 號(hào)、A80號(hào)基因的

14、全長(zhǎng)序列信息，同源性檢索鑒定10號(hào)基因與人類Ⅰ型膠原前α2 鏈有高度的同源性，12 號(hào)基因與人類S100A9基因具有較高同源性，在GenBank中均獲得注冊(cè)。通過對(duì)目標(biāo)基因12 號(hào)基因的蛋白表達(dá)和純化，獲得了有活性的蛋白表達(dá)產(chǎn)物。12 號(hào)蛋白能夠明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增值，并能夠引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞骨架增生，細(xì)胞發(fā)生肥大性反應(yīng)。
　　 4、差異表達(dá)基因VEGF 可能通過促進(jìn)股骨頭壞死區(qū)血運(yùn)重建及骨的形成，間接保護(hù)壞死區(qū)骨小