軟骨干-祖細胞的特性及其促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)再生的研究.pdf

1、背景：
　　 關(guān)節(jié)表面透明軟骨組織具有無神經(jīng)、無血管的解剖結(jié)構(gòu)特征以及緩沖承受人體壓力的功能特征，其自我修復(fù)和再生能力很差。而關(guān)節(jié)軟骨缺損是一類常見疾病，常由運動損傷造成，患者多為年輕人，運動員尤為常見。缺損軟骨長期磨損會導(dǎo)致退行性的骨關(guān)節(jié)病變，隨時間推移發(fā)展為全骨關(guān)節(jié)炎。我國骨關(guān)節(jié)炎的患者約有1億人且呈不斷增加趨勢，其中85-90％都采取保守治療，10-15%的嚴重骨關(guān)節(jié)炎患者需置換人工關(guān)節(jié)。由于極高的患病率和致殘率，昂貴的治

2、療費用，疾病所致的工作能力和生活能力的喪失，骨關(guān)節(jié)炎已成為造成經(jīng)濟損失和影響社會發(fā)展的主要疾病之一。
　　 目前臨床治療骨關(guān)節(jié)炎主要采用對癥治療，關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)腔沖洗，骨髓刺激或自體軟骨塊移植，這些方法各有利弊。對癥治療，關(guān)節(jié)腔沖洗，骨髓刺激等處理方式效果迅速而顯著，但有效持續(xù)時間短暫；自體軟骨塊移植適合于小面積缺損，但移植的軟骨塊不能與周圍的軟骨愈合，長期療效無法確定。
　　 近10年隨著組織工程的興起，臨床醫(yī)學(xué)正步入“

3、再生醫(yī)學(xué)”的新階段。臨床上已成功利用自體軟骨細胞進行缺損軟骨組織的再生治療。種子細胞、支架材料、生長因子是組織工程修復(fù)再生的三大主導(dǎo)因素。在利用組織工程化軟骨再生的過程中，決定其成敗的首要因素是種子細胞。利用自體軟骨細胞移植有諸多限制，首要問題是成體軟骨細胞來源有限。軟骨細胞屬于增殖能力極弱的終末分化的細胞，在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生去分化現(xiàn)象，喪失其成軟骨能力，因此難以用少量的成體軟骨細胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴增獲得大量有正常功能的軟骨細胞，從而限制

4、了自體軟骨組織工程的臨床應(yīng)用。其次是，由臨床自體軟骨細胞關(guān)節(jié)移植病例的追蹤和回訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)關(guān)節(jié)修復(fù)部位，活檢組織中的均一性透明軟骨的比例為40-60%，纖維軟骨的比例占30%-40%，這可能是由于植入的軟骨細胞的個體性能差異，有些細胞能夠形成透明軟骨，有些只形成纖維軟骨。因此，如何提高均一性透明軟骨在修復(fù)軟骨中的比例也是自體軟骨組織工程臨床應(yīng)用的難題。
　　 為解決種子細胞來源不足的問題，干細胞(StemCell)憑借其自

5、我更新能力(Selfrenewal)和多向分化潛能(Pluripotent)的特征，吸引研究者的視線。胚胎干細胞和iPSCs具有軟骨分化能力，有治療軟骨缺損的可能性，研究還處于初期階段。成體干細胞用在軟骨組織再生的研究集中在滑膜和骨髓來源的干細胞。
　　 有研究表明，軟骨組織中可能存在具有多能特性的干細胞：將軟骨細胞在體外低密度種植，有部分細胞表現(xiàn)出成集落的特性。2009年KoellingS所在的德國研究組在定義了軟骨祖細胞(C

6、PC，CartilageProgenitorCell)，該研究將從末期關(guān)節(jié)炎(OA，Osteoarthritis)的軟骨組織中分離出來的具有祖細胞特征的細胞稱為軟骨祖細胞。在這一研究中無法為CPC提供明確的分離標記，在正常軟骨組織中遵循其定義則無法分離出CPC。正常軟骨組織中是否有干細胞？其干細胞是何種來源，有何種特性？人們對軟骨組織中的這些多能干細胞的特性、起源及其應(yīng)用前景都不清楚。
　　 本研究中著重關(guān)注了軟骨干/祖細胞的存

7、在、特征、起源，以及調(diào)控軟骨干/祖細胞生長分化的因素以及其臨床應(yīng)用的探索。而這些科學(xué)問題的明晰將有助于認識軟骨組織的干/祖細胞，從新視角了解骨關(guān)節(jié)軟骨的病理生理以及提升軟骨缺損的細胞治療質(zhì)量。
　　 具體研究分為五部分：
　　 (1)種子細胞(CSPCs)的分離和鑒定；(2)CSPCs的起源和特征；(3)CSPCs的生長分化調(diào)控，CSPCs在炎癥條件下的病理反應(yīng)及對策的研究；(4)構(gòu)建組織工程化軟骨：包括生物活性支架材料

8、的選擇、BMP家族中軟骨生長因子的優(yōu)化、利用軟骨干/祖細胞構(gòu)建組織工程軟骨；(5)組織工程化軟骨的臨床應(yīng)用。
　　 第一章種子細胞(CSPCs)的分離和鑒定研究
　　 目的：軟骨干/祖細胞是近年發(fā)現(xiàn)的，來源于軟骨組織的干細胞。本部分的目的是研究軟骨干/祖細胞的分離收獲方案及與骨髓來源的間質(zhì)干細胞(hBMSC)相比較，檢測其表面標記表達譜，和三系分化能力有何異同。
　　 方法與結(jié)果：在體外試驗中，我們優(yōu)化了軟骨干/

9、祖細胞的培養(yǎng)方案，評估了軟骨干/祖細胞的克隆形成能力，并與骨髓來源的間質(zhì)干細胞定量比較了三系分化能力。結(jié)果顯示，1)低密度、低葡萄糖濃度的培養(yǎng)條件能夠促進軟骨干/祖細胞的增殖。2)軟骨干/祖細胞符合間質(zhì)干細胞的特征，包括表達特定的間質(zhì)干細胞表面標記物，具有克隆形成能力，具有間質(zhì)三系分化潛能。3)與骨髓來源的間質(zhì)干細胞相比，軟骨干/祖細胞成軟骨能力有優(yōu)勢，而骨系和脂肪系分化能力則不如骨髓來源的間質(zhì)干細胞。
　　 結(jié)論：來源于軟骨組

10、織的軟骨干/祖細胞(CSPCs)具有間質(zhì)干細胞的共性和一些軟骨組織特性，可能是體內(nèi)軟骨修復(fù)的理想外源性種子細胞來源。
　　 第二章軟骨干/祖細胞的動態(tài)特征研究
　　 目的：研究軟骨干/祖細胞在正常人和骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者的軟骨組織內(nèi)的起源過程及其動態(tài)變化特征。
　　 方法與結(jié)果：收獲正常人和骨關(guān)節(jié)炎的軟骨組織，在組織學(xué)和細胞學(xué)水平，分別對軟骨組織的特異性基質(zhì)蛋白、間質(zhì)干細胞的表面標志

11、以及骨關(guān)節(jié)炎/CSPCs相關(guān)標志物進行檢測。
　　 我們發(fā)現(xiàn)，1)正常人和骨關(guān)節(jié)炎的軟骨組織中細胞的二型膠原表達均為陽性，CD146的表達均為陰性，但Stro-1和CD271則僅表達于骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中；2)無論是正常人或骨關(guān)節(jié)炎來源的軟骨，CSPCs細胞在分離和傳代過程中，透明軟骨特征蛋白二型膠原的表達在逐漸遞減，而間質(zhì)干細胞的初期表面標志CD146的表達則隨傳代逐漸增加。
　　 結(jié)論：CSPCs從組織到培養(yǎng)過程中，其

12、生長特征，表面標志和功能表型是一個動態(tài)變化過程。
　　 第三章軟骨干/祖細胞生長分化的病理生理因素調(diào)控研究
　　 目的：根據(jù)CSPCs定義中的遷移特性，研究骨關(guān)節(jié)炎中一些常見病理生理因素如炎癥因子和細胞外間質(zhì)成分改變對CSPCs行為的調(diào)控。
　　 方法與結(jié)果：該部分實驗在體外檢測CSPCs在炎性病理相關(guān)條件下細胞行為和功能基因的變化。主要研究：1)炎癥因素對于CSPC的影響；2)NGF對于CSPCs的影響；3)三

13、維微環(huán)境對CSPCs成軟骨能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)，1)在炎癥因子IL-1β的存在條件下，CSPCs自身的IL-1β基因顯著上調(diào)；炎癥因子IL-1β能夠增強CSPCs的NGF的表達；NGF的刺激在基因水平引發(fā)了基質(zhì)基因Agn的表達降低，基質(zhì)降解酶MMP13的表達升高。2)利用Transwell模型發(fā)現(xiàn)：在NGF的刺激下，CSPCs的遷移能力有了顯著增強。利用干細胞體外成軟骨的Pellet模型發(fā)現(xiàn)：NGF，NGF受體抗體，NGF受體抑制劑都能

14、不同程度降低CSPCs的成軟骨能力，而NGF抗體則對于CSPCs成軟骨能力有所提升，具體表現(xiàn)在細胞核形態(tài)和基質(zhì)沉積方面。3)利用脫細胞基質(zhì)(ECM)構(gòu)建三維成軟骨模型我們發(fā)現(xiàn)，CSPCs受不同來源的基質(zhì)影響較大。CSPCs在透明軟骨來源的ECM上表現(xiàn)出更高的軟骨基質(zhì)基因，在半月板來源的ECM上則一型膠原基因升高。
　　 結(jié)論：這項研究闡明了炎性因子對于CSPCs遷移特性的影響，首先發(fā)現(xiàn)了NGF促CSPCs遷移作用。同時加速軟骨基

15、質(zhì)降解，利用NGF抗體部分逆轉(zhuǎn)NGF對CSPCs成軟骨能力的抑制作用。NGF抗體先前報道的能夠抑制關(guān)節(jié)炎疼痛但機制不明，本研究發(fā)現(xiàn)其能夠有效提升CSPCs的成軟骨能力，從軟骨的組織干細胞-CSPCs這一新角度顯示了NGF抗體對骨關(guān)節(jié)炎的治療潛能，為骨關(guān)節(jié)炎治療提供新思路和新證據(jù)。
　　 第四章軟骨干/祖細胞與BMP4再生軟骨研究
　　 目的：利用軟骨干/祖細胞構(gòu)建組織工程化軟骨，并優(yōu)化其生長因子及構(gòu)建方案。
　　

16、 方法與結(jié)果：本研究首先在體外對BMP家族中的有報道的具有促進軟骨分化能力的生長因子BMP2，BMP4和BMP7進行了檢測，基因水平顯示BMP4促進軟骨干/祖細胞的二型膠原表達高于其他組；體外構(gòu)建的組織工程化軟骨，BMP4刺激組體積顯著大于對照組；組織學(xué)表明，BMP4刺激下的CSPCs軟骨基質(zhì)增多明顯。在兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，BMP4顯著促進其軟骨缺損再生和力學(xué)性能增強。
　　 結(jié)論：利用軟骨干/祖細胞能夠構(gòu)建軟骨組織，軟骨干

17、/祖細胞能夠作為軟骨組織工程的種子細胞。生長因子BMP4能夠促進CSPCs軟骨基質(zhì)生成，在兔膝關(guān)節(jié)模型上能促進軟骨修復(fù)效率。
　　 第五章自體軟骨祖細胞的臨床應(yīng)用研究
　　 目的：使用自體軟骨祖細胞移植治療大面積的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。
　　 方法與結(jié)果：對于大面積的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損(6-12cm2)的患者5例，關(guān)節(jié)鏡下獲取200mg左右關(guān)節(jié)非負重區(qū)軟骨組織，然后采用低密度克隆形成技術(shù)擴增軟骨祖細胞至1×107數(shù)以上，隨

18、后進行種子細胞的安全性和功能性檢測，以及體外復(fù)合三維支架，2-3周內(nèi)進行第二次小切口移植手術(shù)。整個過程按照衛(wèi)生部《組織工程化組織移植技術(shù)》三類醫(yī)療新技術(shù)管理規(guī)范，在獲批臨床準入的浙江大學(xué)附屬醫(yī)院骨科開展。術(shù)后立即進行被動屈伸等功能康復(fù)鍛煉，6周內(nèi)部分負重，12周全負重，隨訪時間超過2年，Lysholm、IKDC評分顯著增加，關(guān)節(jié)活動度和疼痛感明顯改善，可自由參加體育活動。
　　 結(jié)論：研究結(jié)果顯示自體軟骨祖細胞具有可以快速擴增用