淫羊藿苷促進關節(jié)軟骨細胞增殖和表型維持及相關機制研究.pdf

1、第一部分淫羊藿苷促進關節(jié)軟骨細胞增殖和表型維持
　　目的：證明淫羊藿苷具有促進大鼠關節(jié)軟骨細胞增殖和表型維持的作用。
　　方法：用CCK8法和流式細胞術測定淫羊藿苷對關節(jié)軟骨細胞增殖的影響；用RT-qPCR、Western Blot、免疫熒光的方法檢測淫羊藿苷對增殖基因（PCNA、Ki67和CyclinD1）表達的影響；用RT-qPCR檢測淫羊藿苷對軟骨特征基因（SOX9、COL2和Aggrecan）表達的影響。
　　

2、結果：在淫羊藿苷作用下，細胞增殖能力得到加強，并且PCNA、Ki67、CyclinD1、SOX9、COL2和Aggrecan的表達增加。
　　結論：淫羊藿苷能有效促進關節(jié)軟骨細胞增殖，并通過上調SOX9、COL2和Aggrecan的表達來維持關節(jié)軟骨表型。
　　第二部分YAP在淫羊藿苷促進關節(jié)軟骨細胞增殖中的作用
　　目的：研究YAP蛋白在淫羊藿苷促進關節(jié)軟骨細胞增殖中的作用。
　　方法：通過RT-qPCR和We

3、stern Blot的方法檢測淫羊藿苷對YAP及其目的基因Ankrd1和CTGF表達的影響；用shRNA沉默YAP，通過RT-qPCR和Western Blot的方法檢測Ankrd1、CTGF、PCNA、Ki67和CyclinD1的表達情況，以及沉默YAP后再用淫羊藿苷干預時，上述基因的表達情況。在體內實驗中，用免疫組化的方法檢測口服淫羊藿苷（每天2mg持續(xù)30天）對大鼠關節(jié)軟骨中YAP和CTGF表達的影響；
　　結果：在體外實驗

4、中，淫羊藿苷能促進YAP、Ankrd1和CTGF的表達；YAP沉默后，Ankrd1、CTGF、PCNA、Ki67和 CyclinD1的表達下調，此時淫羊藿苷不再促進這些基因的表達。在體內實驗中，淫羊藿苷可促進關節(jié)軟骨中YAP和CTGF的表達。
　　結論：淫羊藿苷通過YAP促進關節(jié)軟骨細胞增殖，通過口服淫羊藿苷可以在關節(jié)軟骨局部產生有效的藥物濃度。
　　第三部分淫羊藿苷影響YAP磷酸化修飾的分子機制
　　目的：研究淫羊藿

5、苷影響YAP磷酸化修飾的分子機制以及F-actin與Hippo通路調控YAP活性時的相互關系。
　　方法：淫羊藿苷作用細胞后，用Western Blot方法檢測p-YAP、p-MYPT和p-Cofilin的水平以及用免疫熒光方法檢測YAP蛋白的細胞內定位情況，來觀察YAP蛋白和ROCK通路的活性狀態(tài)。用拉春庫林B作用細胞1小時以及先用淫羊藿苷預處理3天再用拉春庫林B作用細胞1小時，通過Western Blot方法檢測p-YAP的水

6、平以及通過免疫熒光的方法來觀察 F-actin的形態(tài)，以判斷 F-acin是否為淫羊藿苷影響YAP蛋白磷酸化修飾的唯一靶點；通過等重同位素多標簽相對定量（iTRAQ）蛋白質組學來尋找淫羊藿苷影響YAP磷酸化修飾的新機制。
　　結果：淫羊藿苷抑制YAP蛋白磷酸化并促進其進入細胞核；促進MYPT和Cofilin蛋白磷酸化；雖不能阻止拉春庫林B解聚F-action但它能抑制F-actin解聚后引起的YAP蛋白磷酸化。此外，它還能降低SA