紅景天苷調(diào)控大鼠顱骨成骨細(xì)胞表型表達(dá)及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過多次酶消化的方式獲取新生24小時(shí)大鼠顱骨成骨細(xì)胞（rat calvarial osteoblasts, ROB），并以其為研究模型，觀察常氧條件下不同濃度的紅景天苷（salidroside, SAL）對成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的調(diào)控作用，并對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，同時(shí)還觀察了SAL對成骨細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1α）及其下游靶基因血管內(nèi)皮生長

2、因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的調(diào)控作用。
　　方法：1、利用酶消化的方式獲取 ROB細(xì)胞，通過差速貼壁法純化 ROB細(xì)胞，經(jīng)過活細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察、堿性磷酸酶Gomori鈣-鈷法染色及礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色法來鑒定 ROB細(xì)胞，取第三代純化度達(dá)90％以上者用于實(shí)驗(yàn)。2、利用 MTS法檢測ROB細(xì)胞的增殖活性。3、利用磷酸苯二鈉法，使用堿性磷酸酶（alkaline phospha

3、tase, ALP）試劑盒測定 SAL對成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志性基因 ALP活性的影響。4、利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）法檢測成骨細(xì)胞晚期分化的標(biāo)志性基因骨鈣素（osteocalcin, OC）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子 Osterix（Osx）和Runx2及 HIF-1α、VEGF的mRNA表達(dá)水平。5、利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（e

4、nzyme-linked immnosorbent assay, ELISA）測定 OC、VEGF及成骨細(xì)胞早、中期分化的標(biāo)志性基因 I型膠原（Collagen Type1, Col-1）的分泌水平。6、利用茜素紅染色和定量分析法檢測SAL對ROB礦化功能的影響。
　　結(jié)果：1、獲取的ROB細(xì)胞經(jīng) Gomori鈣-鈷法染色后胞質(zhì)內(nèi)有灰黑色的顆粒及塊狀沉淀出現(xiàn)。ROB細(xì)胞經(jīng)不傳代培養(yǎng)13天可形成礦化結(jié)節(jié)，在倒置顯微鏡下觀察呈黑色不透

5、明區(qū)，其經(jīng)茜素紅染色后呈現(xiàn)紅色。2、SAL可顯著促進(jìn) ROB細(xì)胞增殖。3、SAL能顯著增加 ROB細(xì)胞中 ALP、Col-1及 OC的含量促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。4、SAL能夠促進(jìn)ROB細(xì)胞礦化形成礦化結(jié)節(jié)。5、SAL能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子Oterix和Runx2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高。6、SAL能上調(diào)HIF-1α及其下游靶基因VEGF的表達(dá)。
　　結(jié)論：SAL可以促進(jìn)ROB細(xì)胞增殖、分化及礦化；上述作用可能與SAL上調(diào)