人乳腺癌細(xì)胞cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及單抗性質(zhì)的研究.pdf

1、20世紀(jì)90年代以來(lái)，多種人類(lèi)腫瘤抗原基因克隆的成功，大大推動(dòng)了腫瘤免疫學(xué)理論的發(fā)展，也促進(jìn)了腫瘤免疫診斷和免疫治療的應(yīng)用。由于腫瘤抗原在腫瘤診斷與治療中具有重要的靶向作用，因此尋找特異性強(qiáng)、基因功能明確的靶分子成為腫瘤分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的提高和從細(xì)胞受體以及增殖調(diào)控的分子水平對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，開(kāi)始了針對(duì)細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因和調(diào)控分子為靶點(diǎn)的治療，人們稱(chēng)之為“靶向治療”。這些領(lǐng)域包括具有靶向性的表皮

2、生長(zhǎng)因子受體(EGFR)阻斷劑，針對(duì)某些特定細(xì)胞標(biāo)志物的單克隆抗體，針對(duì)某些癌基因和癌的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志的藥物，抗腫瘤血管生成的藥物，抗腫瘤疫苗，基因治療等等，并在不到10年的時(shí)間里有了長(zhǎng)的進(jìn)步。 乳腺癌的發(fā)生與遺傳等因素密切相關(guān)，隨著分子生物學(xué)研究的深入，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤是一種基因性疾病。近年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率日趨增高，在乳腺癌特異抗原標(biāo)志的眾多研究中，除c-erbB-2、EGFR的特異性較高以外，一直未有新的特異性和靈敏度較高的

3、乳腺癌抗原的報(bào)道。 本課題研究針對(duì)我院實(shí)驗(yàn)科制備的多株人乳腺癌單克隆抗體進(jìn)行免疫學(xué)性質(zhì)的研究，并構(gòu)建了人乳腺癌細(xì)胞cDNA噬菌體表達(dá)文庫(kù)，這將為進(jìn)一步利用單抗對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選提供了前期準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.人乳腺癌單抗效價(jià)的測(cè)定及IgG亞類(lèi)的鑒定 利用ELISA方法測(cè)定抗體的效價(jià)，用瓊脂雙向擴(kuò)散鑒定其IgG亞類(lèi)。測(cè)定的六種單克隆抗體(A6、C8、H11、E6、H6、C4)的效價(jià)分別為1:4000，

4、1:8000，1:8000，1:32000，1:1000，1:2000，其中E6的效價(jià)可以達(dá)到106。其IgG亞類(lèi)分別為IgG3，IgG1，IgG3，IgG1，IgG1，IgG3。 2.抗人乳腺癌單抗(E6、H6)在各種腫瘤組織中的免疫組化研究 利用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生素蛋白.過(guò)氧化物酶(SP)法檢測(cè)3例正常人組織，48例腫瘤患者組織，其中包括乳腺、胃、結(jié)腸、肺腺癌各12例。正常組織呈陰性染色，腫瘤組織呈現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞

5、漿陽(yáng)性著色，E6陽(yáng)性表達(dá)率在乳腺癌中為100％(12/12)，在腫瘤組織中綜合表達(dá)率為94％(45/48)，H6陽(yáng)性表達(dá)率在乳腺癌中為92％(11/12)，在腫瘤組織中綜合表達(dá)率為83％(40/48)。 3.人乳腺癌單克隆抗體對(duì)應(yīng)抗原蛋白免疫印跡分析 從乳腺癌組織中提出抗原蛋白質(zhì)，運(yùn)用抗原對(duì)應(yīng)抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，并以正常小鼠血清為蛋白標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果中作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)的小鼠正常血清僅出現(xiàn)兩條條帶，其中一條為重鏈，分子量為54kD

6、，另外一條為輕鏈，分子量為27kD。蛋白樣品僅出現(xiàn)一條條帶，無(wú)非特異性條帶，通過(guò)計(jì)算其分子量為46.414kD。 4.人乳腺癌細(xì)胞cDNA噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定 用SMART技術(shù)，構(gòu)建了人乳腺癌細(xì)胞cDNA噬菌體文庫(kù)，從人乳腺癌細(xì)胞中分離總RNA并純化mRNA，利用經(jīng)修飾的oligo(dT)引物合成cDNA第一鏈，利用SMART核苷酸作為cDNA第一鏈在mRNA5'端延伸出去的模板，采用LD-PCR合成雙鏈cDNA，雙鏈