小亞璃眼蜱唾液腺cDNA表達文庫構建及4D8基因的克隆與原核表達.pdf

1、小亞璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)是一種重要的外寄生蟲，在國內(nèi)主要分布于新疆自治區(qū)的半荒漠草原地區(qū)，除可通過叮咬吸血使宿主生產(chǎn)性能降低外，還可作為許多疾病的傳播媒介，是制約流行區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展、危害居民身體健康的重要因素。 本研究采用分子生物學方法構建了小亞璃眼蜱成蜱半飽血雌蜱唾液腺cDNA表達文庫，首先從小亞璃眼蜱成蜱半飽血雌蜱唾液腺中提取總RNA，并分離純化mRNA，采用oligo(dT)

2、引物合成雙鏈cDNA，在其兩端加EcoR Ⅰ/HindⅢ定向接頭，將所產(chǎn)生的cDNA分子用Mini Column Fractionation凝膠過濾柱純化后定向克隆到λSCREEN載體的EcoRⅠ和HindⅢ的雙酶切位點之間，體外包裝后得到小亞璃眼蜱唾液腺cDNA表達文庫。經(jīng)測定，所構建的表達文庫的容量為4.0x105pfu/mL，擴增后的文庫庫容量為8.8x109pfu/mL，重組率為95％，這說明所構建小亞璃眼蜱唾液腺cDNA表達文

3、庫庫容量大、重組率高。 根據(jù)GenBank已公布的邊緣革蜱4D8基因序列設計引物，采用PCR技術自小亞璃眼蜱成蜱半飽血雌蜱唾液腺cDNA表達文庫中，擴增獲得了4D8基因；將其連入到pMD-18-T載體，構建重組克隆載體pMD-18-Hyaa4D8，測序分析表明，克隆的小亞璃眼蜱4D8基因與GenBank上公布的邊緣革蜱4D8基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為89.2％和96.0％。然后對重組克隆載體pMD-18-Hyaa4D

4、8進行雙酶切，獲得帶有粘性末端的4D8基因片段，并將此片段定向亞克隆到原核表達載體pGEX-4T-1，成功構建重組原核表達載體pGEX-4T-1-Hyaa4D8。將其轉化到BL21宿主菌中，用IPTG進行誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表達產(chǎn)物為分子量為45 ku的融合蛋白，其表達蛋白濃度為1.24 mg/mL，目的蛋白約占菌體總蛋白的33.0％。采用Western-blotting實驗，分析表明此表達產(chǎn)物能被小亞璃眼蜱唾液腺免疫兔血