半枝蓮抗腫瘤活性成分篩選及AhR基因敲除的肝癌細(xì)胞的初步構(gòu)建.pdf

1、人體約80％～90％的腫瘤是由化學(xué)致癌物引起的?；瘜W(xué)致癌物在進(jìn)入體內(nèi)后，要受到體內(nèi)各種酶的代謝，Ⅱ相酶在防治腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。半枝蓮中黃酮類化合物能很好的清除體內(nèi)的自由基，起到抗腫瘤的作用。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)半枝蓮黃酮類化合物能誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶的表達(dá)，但半枝蓮黃酮類化合物種類眾多，對(duì)于各化合物的作用及其機(jī)理仍未明確。因此，我們開展了對(duì)半枝蓮黃酮類化合物活性成分及其機(jī)理的進(jìn)一步研究。
　　第一部分 ARE調(diào)控的綠色

2、熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞對(duì)半枝蓮不同極性部位的黃酮類化合物篩選
　　目的:
　　通過ARE（anti-oxidative response element，抗氧化反應(yīng)元件）調(diào)控的綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞模型來(lái)篩選半枝蓮7個(gè)不同極性部位的黃酮類化合物(A、B、C、D、E、F、G)，初步探討半枝蓮黃酮類化合物活性成分。
　　方法:
　　使用終濃度為50μg/mL的黃酮類化合物(A、B、C、D、E、F、G)以及終濃度為10

3、0μM的tBHQ（tertiary butylhydroquinone，叔丁基對(duì)苯二酚）分別對(duì)ARE調(diào)控的綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞Hep G2-4ARE-TK-GFP處理24小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GFP(Greenfluorescent protein，綠色熒光蛋白)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。并檢測(cè)陽(yáng)性黃酮類化合物G的劑量效應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　黃酮類化合物G顯示結(jié)果為陽(yáng)性，相對(duì)熒光強(qiáng)度為1.97倍，而黃酮類化合物A、B、C、D、E、F均為陰

4、性。黃酮類化合物G濃度在80μg/mL時(shí)取得最大活性。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)對(duì)前期提取的7個(gè)不同半枝蓮黃酮類化合物進(jìn)行篩選，其中黃酮類化合物G為其主要活性成分。
　　第二部分 AhR基因敲除HepG2細(xì)胞模型的的初步構(gòu)建
　　目的:
　　通過CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats—CRISPRassociated system，C

5、RISPR-Cas9基因編輯技術(shù))基因打靶技術(shù)敲除Hep G2(Humanhepatocellular hver carcinoma cell line，人肝癌細(xì)胞系)內(nèi)的AhR（aryl hydrocarbon receptor，芳香烴受體）基因，驗(yàn)證其可行性，為進(jìn)一步構(gòu)建AhR基因缺失的ARE調(diào)控的綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞Hep G2-4ARE-TK-GFP提供基礎(chǔ)
　　方法:
　　針對(duì)AhR基因設(shè)計(jì)了三個(gè)sgRNA（s

6、mall guide RNA，引導(dǎo)RNA）位點(diǎn)，合成其對(duì)應(yīng)的oligo雙鏈DNA后與線性的載體GV392連接后構(gòu)建AHR-sgRNA載體。對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行慢病毒包裝后對(duì)培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染陽(yáng)性結(jié)果抽提DNA后PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增，使用錯(cuò)配酶法檢測(cè)sgRNA活性
　　結(jié)果:
　　對(duì)AHR-sgRNA載體測(cè)序結(jié)果中找到了相應(yīng)的sgRNA序列，在隨后的感

7、染后HepG2細(xì)胞內(nèi)sgRNA活性的檢測(cè)中，三個(gè)sgRNA均表現(xiàn)出了活性，其中sgRAN3的活性最強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR-Cas9基因打靶技術(shù)成功敲除了Hep G2細(xì)胞內(nèi)的AhR基因，成功構(gòu)建了AhR基因缺失的Hep G2細(xì)胞，驗(yàn)證了使用CRISPR-Cas9基因打靶敲除Hep G2細(xì)胞內(nèi)AhR基因的可行性，對(duì)下一步構(gòu)建Nrf2/Keap1（nuclear factor erythroid-2p45-r