豬肺組織cDNA文庫的構建及APP OmpA酵母雙雜交的篩選.pdf

1、SiChUanAgriCU1tUra1UniVersitYDISSERTATIoNSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEConstructionofacDNAlibraryofswinelungtissueandyeasttwohybridScreenwithOutermembraneproteinAofActinobacilluspleuropneumo

2、niaeZhangqian(preventiveVeterinariarymedicine)DirectedbyProf舭nxintianCaosanjieChengdu，SichuanJune2015摘要豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumoniae，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌似ctinobacilluspleuropneumoniae，APP)弓I起豬的一種呼吸道疾病，該病對養(yǎng)豬生產(chǎn)業(yè)造成嚴重

3、的經(jīng)濟損失。外膜蛋Et(outermembraneprotein，OMP)是胸膜肺炎放線桿菌的眾多毒力因子之一。本研究主要進行了豬肺組織eDNA文庫構建及APPOmpA酵母雙雜交陽性克隆子篩選研究，為進一步深入研究OmpA感染豬肺的致病機理奠定堅實基礎，主要研究工作如下：1豬肺組織cDNA文庫的構建與鑒定以28日齡健康仔豬的肺組織為材料，Trizol法提取豬肺組織總RNA，分離純化mRNA，以Invitrogen反轉錄酶合成eDNA第一

4、鏈，經(jīng)LD—PCR擴增得到雙鏈eDNA，再經(jīng)BDCHROMASPINColumns純化雙鏈eDNA，除去較小的片段，將eDNA與含有DNA激活域(DNAAD)的酵母表達載體pGADT7Rec連接，電轉化轉入大腸桿菌DHl0B感受態(tài)中，收獲克隆子即為豬肺組織cDNA文庫，經(jīng)鑒定最終得到的eDNA文庫總容量為11xlO7cfu，插入片段平均長度在15Kb左右，文庫陽性克隆率為100％，證明該試驗成功構建了豬肺組織eDNA文庫，為豬肺部致病菌

5、的致病機理方面的研究奠定了基礎。2APP外膜蛋白OmpA酵母雙雜交誘餌質粒構建與鑒定以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型野毒株基因組全長序列為模板，特異性引物擴增去掉信號肽后的外膜蛋AOmpA片段。將該片段與含有DNA結合域(DNABD)的酵母表達載體pGBKT7一Rec連接，獲得pGBKT7OmpA誘餌載體，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定均獲得大小約為1，100bp的目的條帶；將該誘餌載體通過醋酸鋰法轉入酵母感受態(tài)AHl09細胞中，在加有卡那霉素的S

6、D／一Trp營養(yǎng)缺陷性瓊脂培養(yǎng)基上收獲轉化子，即為pGBKT7OmpA誘餌菌，通過對該誘餌菌進行自激活性檢測和細胞毒性檢測結果：該誘餌在SD／Trp／His、SD／Trp／Ade、SD／Trp／His／Ade／Leu缺陷性固體培養(yǎng)基上均無克隆生長，且在SD／Trp、SD／Trp／X0【gal生長為白色菌落，表明該誘餌菌不能自主激活報告基因HIS3、ADE2和MELl；在SD／一Trp液體培養(yǎng)基培養(yǎng)22h后，其菌液OD600值在08以上，