黃瓜超矮生基因scp-1功能初步分析及酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、株高是影響黃瓜生產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀，目前對(duì)黃瓜株高調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道較少。油菜素甾醇類化合物(BRs)是調(diào)控植物株高的主要激素之一，對(duì)BR矮生突變體的研究有助于揭示黃瓜株高調(diào)控的分子機(jī)制。課題組前期以一個(gè)超矮生黃瓜突變體C257為材料，已將其矮生突變基因scp-1定位在6.6cM區(qū)間，結(jié)合MutMap分析，在其定位區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)有8個(gè)基因的14個(gè)SNP發(fā)生了非同義突變。本研究在上述工作基礎(chǔ)上，克隆了scp-1候選基因，并對(duì)scp-1進(jìn)行功能初

2、步分析。此外，黃瓜的下胚軸是黃瓜植株的第一節(jié)間，下胚軸及其以上節(jié)間共同決定了黃瓜的株高，下胚軸的長(zhǎng)度也與壯苗和田間定植密切相關(guān)。本試驗(yàn)以CCMC的葉片和下胚軸為材料，構(gòu)建了黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，并篩選黃瓜長(zhǎng)下胚軸突變體候選基因CsLH1的互作蛋白。主要結(jié)果如下:
　　1、依據(jù)突變體C257的表型和暗形態(tài)建成，表明C257為BR相關(guān)突變體。外源油菜素內(nèi)酯(BL)噴施處理能夠恢復(fù)C257的部分表型，說(shuō)明C257為BR合成缺陷突變

3、體?？寺×薈257和CCMC的scp-1候選基因CsCYP85A，序列比對(duì)結(jié)果表明，在C257的CsCYP85A基因編碼區(qū)470bp位置，發(fā)生了G到A的堿基突變，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白被截短。利用該位點(diǎn)設(shè)計(jì)CsCYP85A-dCAPS標(biāo)記，在C257與GY14的F2小群體中進(jìn)行遺傳連鎖分析，結(jié)果表明，CsCYP85A-dCAPS標(biāo)記與scp-1共分離;在412份黃瓜種質(zhì)中對(duì)C257的CsCYP85A突變位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)多樣性分析，結(jié)果表明此突

4、變位點(diǎn)是唯一的。以上結(jié)果表明CsCYP85A是scp-1最可能的候選基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在黃瓜基因組有3個(gè)CsCYP85A基因，依次命名為CsCYP85A1、CsCYP85A2和CsCYP85A3，其中CsCYP85A1在突變體和野生型植株的雄花、雌花、莖、葉、根均表達(dá)，而CsCYP85A2和CsCYP85A3的表達(dá)量難以檢測(cè)。CsCYP85A1在野生型植株中的表達(dá)受BL反饋調(diào)節(jié)抑制，而在突變體中則不受影響。
　　2、以

5、華北型密刺黃瓜CCMC植株幼苗期葉片和下胚軸為材料，構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，經(jīng)檢測(cè)庫(kù)容為9.45×105cfu，文庫(kù)滴度為9.72×107cfu/ml，文庫(kù)插入片段主要分布在250～2000bp之間，重組克隆陽(yáng)性率≥80％。
　　3、構(gòu)建黃瓜長(zhǎng)下胚軸突變體候選基因CsLH1的誘餌載體，通過(guò)酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證，初步證明CsLH1與CsHY5互作。利用構(gòu)建的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，初步篩選到一個(gè)與CsLH1互作的蛋白GATA t