山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒ENTV cDNA文庫的構(gòu)建及功能基因的初步表達(dá).pdf

1、地方性鼻內(nèi)腫瘤病是一種以呼吸道鼻內(nèi)粘膜分泌型上皮細(xì)胞發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化為特征的接觸性傳染病，主要發(fā)生于山羊和綿羊，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為連續(xù)性鼻漏、呼吸困難、眼球突出、顱骨變形、面部腫大、噴嚏、打鼾和極度消瘦。除澳大利亞和新西蘭外，所有其他主要養(yǎng)羊國家都有該病的流行，發(fā)病率為0.1％-15％，給各國養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的損失。在國內(nèi)，該病主要流行于內(nèi)蒙古、湖南及四川等主要養(yǎng)羊地區(qū)，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)厣窖蚍N質(zhì)資源的發(fā)展。目前，國內(nèi)對該病病原學(xué)的研究甚少

2、，僅有幾例山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤性疾病病理學(xué)的相關(guān)研究報(bào)道。為了深入認(rèn)識該病，本研究進(jìn)行了以下幾方面的工作：
　　 Ⅰ.山羊地方性鼻內(nèi)腺瘤病毒ENTVcDNA文庫的構(gòu)建和基因組解析
　　 根據(jù)NCBI中收錄的ENTV基因組序列設(shè)計(jì)6對引物，利用RT-PCR技術(shù)從山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤自然感染病例的鼻液中的病毒RNA中分段擴(kuò)增出相應(yīng)片段，經(jīng)TA克隆篩選及測序鑒定，成功克隆了重組質(zhì)粒pMD-i、pMD-ii、pMD-iii、pMD-

3、iv、pMD-V、pMD-vi，構(gòu)建了包含ENTV基因組序列的cDNA文庫。序列分析結(jié)果顯示，相應(yīng)的gag編碼區(qū)和env編碼區(qū)均含有ENTV的獨(dú)特區(qū)，與ENTV-2(登錄號：NC_004994)對應(yīng)序列的相似性分別為88％、90％、93％、88％和92％，而與JSRV及ERVs的差異性較大。序列拼接結(jié)果顯示，ENTV基因組序列包含5，端非編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)和相互重疊的gag-pro-pol-env編碼區(qū)，基因組全長為7168bp。<

4、br>　　 Ⅱ.山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒ENTV功能基因的分子克隆及初步表達(dá)研究
　　 利用PCR技術(shù)從ENTVcNDA文庫中成功亞克隆了ENTVgag、env、SU、TM和SD的編碼區(qū)，構(gòu)建了pMD-gag、pMD-env、pMD-SU、pMD-TM和pMD-SD的亞克隆，并構(gòu)建了表達(dá)這些編碼區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒(pET-gag、pEGFP-env、pEGFP-SU、pEGFP-TM和pEGFP-SD)。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-ga