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文檔簡介
1、辣椒(Capsicum annuum L.)是一種具有重要經(jīng)濟價值的茄科作物,而在生產(chǎn)過程中包括病害在內(nèi)的各種生物和非生物逆境的發(fā)生嚴(yán)重地影響辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量。培育,推廣及應(yīng)用抗逆品種是當(dāng)前和今后解決辣椒品質(zhì)問題的最為根本有效的技術(shù)對策,辣椒抗病分子機制的闡明則有利于促進現(xiàn)代生物技術(shù)和常規(guī)育種相結(jié)合,進而有效的促進辣椒抗逆遺傳改良。大量的研究表明,包括病原菌在內(nèi)的逆境脅迫可激活植物防御反應(yīng),這種誘導(dǎo)抗性在植物抗逆過程中起重要作用,這一過
2、程受逆境脅迫下信號傳遞途徑的控制,其中轉(zhuǎn)錄因子通過整合外界信號和協(xié)調(diào)基因表達的過程中起重要作用參與了該過程。開展辣椒應(yīng)答逆境的重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能鑒定有利于揭示辣椒抗逆分子機制,促進辣椒抗逆遺傳改良。因此,本研究為了分離獲得若干可能在辣椒抗病或抗逆防御反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用轉(zhuǎn)錄因子,首先構(gòu)建了外源SA處理的辣椒均一化cDNA文庫,從中分別分離獲得2個NAC和1個ERF轉(zhuǎn)錄因子陽性克隆,對所分離陽性克隆進行了與特定順式作用原件互作的瞬間
3、表達、亞細(xì)胞定位以及在不同逆境下轉(zhuǎn)錄表達的熒光定量PCR分析,并對ERF在煙草中超表達對青枯菌接種抗性和高溫抗性的影響進行了分析,主要研究結(jié)果如下:
1.采用DSN均一化技術(shù)與SMART建庫技術(shù)相結(jié)合的方法,構(gòu)建了在SA處理下辣椒全長均一化cDNA文庫,該文庫含有1.8×106個獨立克隆,插入片段平均長度為1.5 kb,重組率為99%,經(jīng)測序獲得unigenes數(shù)目為817,冗余度為5.5%,文庫的均一化效果良好,質(zhì)量符合
4、要求。
2.采用文庫稀釋池法從全長均一化cDNA文庫中分離獲得了兩個辣椒NAC陽性克隆CaNAC6和CaNAC2。兩個NAC蛋白都包含有NAC類轉(zhuǎn)錄因子特有的NAC域和C末端的可變域。蛋白結(jié)構(gòu)域和分子進化分析表明CaNAC6屬于第Ⅲ(stress-related NAC genes,SNAC)亞族,CaNAC2屬于第Ⅰ-5(NAC2)亞族。酵母實驗表明,CaNAC6和CaNAC2的C末端均具有轉(zhuǎn)錄激活活性。兩個蛋白均可結(jié)合
5、NAC類轉(zhuǎn)錄因子的識別序列NACRS序列?;驑尳閷?dǎo)的洋蔥表皮轉(zhuǎn)化實驗表明,35S::CaNAC6-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中,35S::CaNAC2-GFP融合蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有表達。熒光定量結(jié)果表明,NAA處理下CaNAC6上調(diào)表達,CaNAC2在短時間內(nèi)表現(xiàn)為下調(diào)。CaNAC6可由SA,MeJA,ETH,ABA,機械損傷,青枯菌及干旱誘導(dǎo)表達。CaNAC2由SA,MeJA,青枯菌,干旱誘導(dǎo)表達,ABA作用下無明顯變化,在
6、乙烯利作用下表現(xiàn)為一定程度的下調(diào)。兩個基因的表達水平在4℃冷處理時均在處理后48 h上調(diào),在NaCl和42℃高溫處理一定時間內(nèi)都表現(xiàn)出下調(diào)。
4.從均一化cDNA文庫中分離了一個辣椒ERF陽性克隆CaERF5。洋蔥表皮轉(zhuǎn)化實驗表明35S::CaERF5-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中。瞬時表達結(jié)果表明CaERF5結(jié)合GCC-box而不結(jié)合CRT/DRE元件。分子進化和序列分析表明CaERF5屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子IXb亞族家族成
7、員。
5.表達模式分析表明,CaERF5在青枯菌侵染后24-96 h間上調(diào)表達,并受SA,MeJA,ETH,機械損傷、低溫、高溫作用誘導(dǎo),但不受ABA誘導(dǎo),在干旱處理下下調(diào)表達。相對于K326,除NtNPR1外,包括NtPR2,Ntosmotin,NtACS,NtPR1b,NtPR3,NtPRQ,NtMLP2及NtGST1在內(nèi)的防御反應(yīng)相關(guān)基因在過量表達CaERF5轉(zhuǎn)基因株系中表達量顯著上調(diào)。CaERF5過量表達的轉(zhuǎn)基因煙
8、草在接種青枯菌后一系列防御反應(yīng)相關(guān)基因Ntosmotin,NtNPR1,NtPR3,NtPR1b,NtPRQ,NtMLP2,NtCAT1,NtGST1及NtACC均在48 h和96 h表達量無明顯組間差異,而在野生型K326中,接種青枯菌96 h后這一系列基因依然呈誘導(dǎo)表達狀態(tài)。此外,青枯菌接種48h和96h后過量表達CaERF5植株中兩個熱激蛋白基因(NtHSP和NtHSP18)表達水平較K326均有一定程度的提高。42℃高溫處理下C
9、aERF5轉(zhuǎn)基因株系在高溫脅迫下萌芽率明顯高于K326,并且幼苗表現(xiàn)出較強的高溫耐受能力。
綜上所述,本研究構(gòu)建了一個外源SA處理的辣椒均一化cDNA文庫,從中分離獲得2個NAC(CaNAC6和CaNAC2)和1個ERF(CaERF5)轉(zhuǎn)錄因子陽性克隆,初步分析表明,CaNAC6和CaNAC2可能參與了辣椒響應(yīng)不同生物和非生物逆境的過程。定位于細(xì)胞核可與GCC盒結(jié)合的CaERF5的轉(zhuǎn)錄表達同樣受各種生物和非生物逆境不同程度
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