辣椒均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及若干重要基因的表達(dá)或功能分析.pdf

1、辣椒(Capsicum annuum L.)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的茄科作物，而在生產(chǎn)過(guò)程中包括病害在內(nèi)的各種生物和非生物逆境的發(fā)生嚴(yán)重地影響辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量。培育，推廣及應(yīng)用抗逆品種是當(dāng)前和今后解決辣椒品質(zhì)問(wèn)題的最為根本有效的技術(shù)對(duì)策，辣椒抗病分子機(jī)制的闡明則有利于促進(jìn)現(xiàn)代生物技術(shù)和常規(guī)育種相結(jié)合，進(jìn)而有效的促進(jìn)辣椒抗逆遺傳改良。大量的研究表明，包括病原菌在內(nèi)的逆境脅迫可激活植物防御反應(yīng)，這種誘導(dǎo)抗性在植物抗逆過(guò)程中起重要作用，這一過(guò)

2、程受逆境脅迫下信號(hào)傳遞途徑的控制，其中轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)整合外界信號(hào)和協(xié)調(diào)基因表達(dá)的過(guò)程中起重要作用參與了該過(guò)程。開(kāi)展辣椒應(yīng)答逆境的重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能鑒定有利于揭示辣椒抗逆分子機(jī)制，促進(jìn)辣椒抗逆遺傳改良。因此，本研究為了分離獲得若干可能在辣椒抗病或抗逆防御反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用轉(zhuǎn)錄因子，首先構(gòu)建了外源SA處理的辣椒均一化cDNA文庫(kù)，從中分別分離獲得2個(gè)NAC和1個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子陽(yáng)性克隆，對(duì)所分離陽(yáng)性克隆進(jìn)行了與特定順式作用原件互作的瞬間

3、表達(dá)、亞細(xì)胞定位以及在不同逆境下轉(zhuǎn)錄表達(dá)的熒光定量PCR分析，并對(duì)ERF在煙草中超表達(dá)對(duì)青枯菌接種抗性和高溫抗性的影響進(jìn)行了分析，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.采用DSN均一化技術(shù)與SMART建庫(kù)技術(shù)相結(jié)合的方法，構(gòu)建了在SA處理下辣椒全長(zhǎng)均一化cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)含有1.8×106個(gè)獨(dú)立克隆，插入片段平均長(zhǎng)度為1.5 kb，重組率為99％，經(jīng)測(cè)序獲得unigenes數(shù)目為817，冗余度為5.5％，文庫(kù)的均一化效果良好，質(zhì)量符合

4、要求。
　　 2.采用文庫(kù)稀釋池法從全長(zhǎng)均一化cDNA文庫(kù)中分離獲得了兩個(gè)辣椒NAC陽(yáng)性克隆CaNAC6和CaNAC2。兩個(gè)NAC蛋白都包含有NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子特有的NAC域和C末端的可變域。蛋白結(jié)構(gòu)域和分子進(jìn)化分析表明CaNAC6屬于第Ⅲ(stress-related NAC genes，SNAC)亞族，CaNAC2屬于第Ⅰ-5(NAC2)亞族。酵母實(shí)驗(yàn)表明，CaNAC6和CaNAC2的C末端均具有轉(zhuǎn)錄激活活性。兩個(gè)蛋白均可結(jié)合

5、NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別序列NACRS序列?；驑尳閷?dǎo)的洋蔥表皮轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，35S：：CaNAC6-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中，35S：：CaNAC2-GFP融合蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有表達(dá)。熒光定量結(jié)果表明，NAA處理下CaNAC6上調(diào)表達(dá)，CaNAC2在短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)為下調(diào)。CaNAC6可由SA，MeJA，ETH，ABA，機(jī)械損傷，青枯菌及干旱誘導(dǎo)表達(dá)。CaNAC2由SA，MeJA，青枯菌，干旱誘導(dǎo)表達(dá)，ABA作用下無(wú)明顯變化，在

6、乙烯利作用下表現(xiàn)為一定程度的下調(diào)。兩個(gè)基因的表達(dá)水平在4℃冷處理時(shí)均在處理后48 h上調(diào)，在NaCl和42℃高溫處理一定時(shí)間內(nèi)都表現(xiàn)出下調(diào)。
　　 4.從均一化cDNA文庫(kù)中分離了一個(gè)辣椒ERF陽(yáng)性克隆CaERF5。洋蔥表皮轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明35S：：CaERF5-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中。瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明CaERF5結(jié)合GCC-box而不結(jié)合CRT/DRE元件。分子進(jìn)化和序列分析表明CaERF5屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子IXb亞族家族成

7、員。
　　 5.表達(dá)模式分析表明，CaERF5在青枯菌侵染后24-96 h間上調(diào)表達(dá)，并受SA，MeJA，ETH，機(jī)械損傷、低溫、高溫作用誘導(dǎo)，但不受ABA誘導(dǎo)，在干旱處理下下調(diào)表達(dá)。相對(duì)于K326，除NtNPR1外，包括NtPR2，Ntosmotin，NtACS，NtPR1b，NtPR3，NtPRQ，NtMLP2及NtGST1在內(nèi)的防御反應(yīng)相關(guān)基因在過(guò)量表達(dá)CaERF5轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量顯著上調(diào)。CaERF5過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙

8、草在接種青枯菌后一系列防御反應(yīng)相關(guān)基因Ntosmotin，NtNPR1，NtPR3，NtPR1b，NtPRQ，NtMLP2，NtCAT1，NtGST1及NtACC均在48 h和96 h表達(dá)量無(wú)明顯組間差異，而在野生型K326中，接種青枯菌96 h后這一系列基因依然呈誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài)。此外，青枯菌接種48h和96h后過(guò)量表達(dá)CaERF5植株中兩個(gè)熱激蛋白基因(NtHSP和NtHSP18)表達(dá)水平較K326均有一定程度的提高。42℃高溫處理下C

9、aERF5轉(zhuǎn)基因株系在高溫脅迫下萌芽率明顯高于K326，并且幼苗表現(xiàn)出較強(qiáng)的高溫耐受能力。
　　 綜上所述，本研究構(gòu)建了一個(gè)外源SA處理的辣椒均一化cDNA文庫(kù)，從中分離獲得2個(gè)NAC(CaNAC6和CaNAC2)和1個(gè)ERF(CaERF5)轉(zhuǎn)錄因子陽(yáng)性克隆，初步分析表明，CaNAC6和CaNAC2可能參與了辣椒響應(yīng)不同生物和非生物逆境的過(guò)程。定位于細(xì)胞核可與GCC盒結(jié)合的CaERF5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)同樣受各種生物和非生物逆境不同程度