TGF-β對白血病細胞株Gli1、Gli2表達的影響.pdf

1、目的：
　　 Hedgehog(HH)信號轉導通路廣泛存在于胚胎發(fā)育不同組織及時期,是胚胎發(fā)育過程中的主要調節(jié)信號通路之一,在組織的損傷與修復中發(fā)揮著開啟正常干細胞自我更新的功能。但HH信號轉導通路過度激活卻可誘使正常干細胞轉化成癌干細胞,最終導致癌的發(fā)生。眾多研究表明該通路與包括白血病在內的多種腫瘤性疾病相關,因此抑制該通路有可能成為腫瘤預防和治療的新靶點。
　　 Gli作為轉錄因子,是刪信號轉導通路的最后一個環(huán)節(jié),其

2、下游基因包括多種與細胞增生分化相關的基因,可能是該通路導致腫瘤的關鍵因素。這些基因包括調節(jié)細胞增生和分化的基因,維持細胞生長的基因,促進細胞自我更新的基因,血管生成相關基因,上皮基質轉化基因和侵襲基因。這些均提示該通路的活化可能不僅和腫瘤的發(fā)生相關,還與腫瘤的復發(fā),轉移相關。Gli分子本身與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展并沒有直接關系,但直接調控腫瘤細胞增殖、分化和轉移的分子基因轉錄水平則受到HH信號通路調控。
　　 最近的研究傾向于其他途

3、徑對Gli的非經(jīng)典激活,發(fā)現(xiàn)在有的腫瘤中存在由TGF-β信號通路介導的Gli的非經(jīng)典激活。TGF-β作為細胞因子,對白血病細胞可以有一系列的影響,包括抑制細胞增殖和誘導分化、改變粘附分子和細胞因子受體表達,以及誘導細胞凋亡等。TGF-β1在TGFβ家系中發(fā)現(xiàn)最早,且生物活性最強,在造血調控方面起重要作用。
　　 那么,在白血病中是否同樣存在tGF-β信號通路對Gli的調控作用呢?本研究應用TGF-β作用于白血病HL-60和u93

4、7細胞株,檢測HH通路中Gli1和Gli2的mRNA和蛋白表達的變化,并檢測tNF-α以及SIS3對HH通路中Gli1和Gli2的mRNA和蛋白表達的影響,從而證明在白血病HL-60和U937細胞株中同樣存在TGF-β信號通路對Gli的調控作用,為白血病發(fā)病機制的完善提供新的思路,為白血病的治療提供新的靶點。
　　 方法：
　　 1、TGF-β對HL-60和U937細胞株Gli1、G1i2表達的影響
　　 (1)

5、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml TGF-β1分別作用于HL-60和U937細胞24h、48h和72h后,MTT法檢測HL-60細胞和U937細胞的增殖情況。(2)5ng/ml TGF-β1作用于HL-60細胞和U937細胞72h后,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。(3)用0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml TGF-β1分別作用于HL-60細胞和U937細胞,時間分別為6h、12h、24h。處理

6、結束后收集細胞,提取mRNA,檢測Gli1和Gli2的表達。(4)5ng/ml TGF-β1、5ng/ml TGF-β1+5μM SIS3分別作用于U937細胞24h。處理結束后收集細胞,提取mRNA和蛋白,檢測Gli1和Gli2的表達。(5)PCR反應判定HL-60細胞和U937細胞是否表達Ptch和Smo基因。(6)5μM SIS3作用于HL-60細胞和U937細胞,時間分別為6h、12h、24h。處理結束后收集細胞,提取mRNA和

7、蛋白,檢測Gli1和Gli2的表達。(7)對照組細胞在不含任何處理因素的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。(8)ELISA法分別檢測正常人血清、HL-60細胞和U937細胞培養(yǎng)上清TGF-β1水平.
　　 2、TGF-β和TNF-α協(xié)同作用于HL-60和U937細胞株對Gli1、Gli2表達的影響
　　 (1)5ng/mlTNF-α和0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml TGF-β1分別作用于HL-60

8、細胞和U937細胞24h、48h和72h,MTT法檢測HL-60細胞和U937細胞的增殖情況。(2)5ng/mlTNF-α+5ng/mlTGF-β1作用于HL-60細胞和U937細胞72h,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。(3)5ng/mlTNF-α作用于HL-60細胞和U937細胞24h。處理結束后收集細胞,提取蛋白,檢測TGF-βR I和TGF-β RⅡ蛋白表達。(4)5ng/mlTNF-α作用于HL-60細胞和U937細胞,作用時間分

9、別為12h、24h、48h。處理結束后收集細胞,提取mRNA,檢測Gli1和Gli2的表達。(5)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ M SIS3分別作用于HL-60細胞24h;5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5μM SIS3和5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ M SIS3分別

10、作用于U937細胞24h。處理結束后收集細胞,提取mRNA和蛋白,檢測Gli1和Gli2的表達。(6)對照組細胞在不含任何處理因素的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　 結果：
　　 1、TGF-β對HL-60和U937細胞株Gli1、Gli2表達的影響
　　 (1)0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于HL-60細胞24h、48h和72h,對HL-60細胞的增殖沒有明顯影

11、響:1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于U937細胞24h、48h和72h,U937細胞的增殖受到抑制,并且隨時間的延長抑制更加顯著。
　　 (2)5ng/ml TGF-β1作用于HL-60細胞和U937細胞72h,U937細胞凋亡細胞百分比明顯增加,而HL-60細胞凋亡細胞百分比沒有明顯變化。
　　 (3)0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/mlTGF-β1分別作用于HL-60細胞6h、12h、24h

12、,各組間及其與對照組間比較,Gli1、Gli2的mRNA表達沒有明顯差異。
　　 0.1ng/mlTGF-β1作用于U937細胞6h、12h、24h,與對照組比較Gli1、Gli2的mRNA表達沒有明顯差異;1ng/mlTGF-β1和10ng/mlTGF-β1分別作用于U937細胞6h、12h、24h,從12h起并至少持續(xù)至24h,其Gli1、Gli2的mRNA表達較對照組明顯減少;而1ng/mlTGF-β1組和10ng/mlT

13、GF-β1組,其組間比較Gli1、Gli2的mRNA表達沒有明顯差異。
　　 (4)5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5μM SIS3分別作用于U937細胞24h,其Gli1、Gli2的mRNA和蛋白表達與對照組比較:5ng/mlTGF-β1組較對照組降低,而5ng/mlTGF-β1+5μ M SIS3組較對照組明顯增高。
　　 (5)HL-60細胞和U937細胞不表達Ptch和Smo基因。
　　

14、 (6)5μ M SIS3分別作用于HL-60細胞和U937細胞6h、12h、24h,其Gli1、Gli2的mRNA表達和蛋白表達與對照組比較:Gli1、Gli2表達較對照組明顯增高;并且隨著作用時間的延長,差異更加顯著。
　　 (7)HL-60和U937細胞的培養(yǎng)上清TGF-β1水平明顯低于正常人。
　　 2、TGF-β和TNF-α協(xié)同作用于HL-60和U937細胞株對Gli1、Gli2表達的影響
　　 (1

15、)在TNF-α的協(xié)同作用下1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于HL-60細胞和U937細胞24h、48h和72h,HL-60細胞和U937細胞的增殖均受到抑制,并且隨時間延長抑制更加顯著。
　　 (2)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α作用于HL-60細胞和U937細胞72h,HL-60細胞和U937細胞的凋亡細胞百分比均明顯增加.
　　 (3)5ng/mlTNF-α分別作用于HL-60細胞和U

16、937細胞24h,各組與對照組間比較,TGF-β R I和TGF-β RⅡ蛋白表達較對照組增高。
　　 (4)5ng/mlTRF-α分別作用于HL-60細胞和0937細胞12h、24h、48h,各組間及其與對照組間比較,Gli1、Gli2的mRNA表達沒有明顯差異。
　　 (5)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μM SIS3分別作用于HL-60細胞24

17、h,其Gli1、Gli2的mRNA和蛋白表達各組間及其與對照組間比較:5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α組較對照組降低,而5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ MSIS3組則較對照組升高。
　　 5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5μ MSIS3和5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ MSIS3分別作用于U937

18、細胞24h,其Gli1、Gli2的mRNA表達和蛋白表達各組間及其與對照組間比較:5ng/mlTGF-B1組、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α組均較對照組降低;5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α組較5ng/mlTGF-β1組更低;5ng/mlTGF-β1+5μ MSIS3組和5ng/mlTGF-β1+5ng/m1TNF-α+5μ MSIS3組均較對照組增高。
　　 結論：
　　 1、單獨應用

19、TGF-β可以降低U937細胞Gli1、Gli2的表達,對HL-60細胞Gli1、Gli2的表達則沒有影響;TGF-β降低U937細胞Gli1、Gli2的表達是通過TGF-β/Smad3途徑介導的,可被SIS3所抑制,不依賴于Ptch/Smo途徑;HL-60細胞和U937細胞分泌的TGF-β可能降低Gli1、Gli2的表達。
　　 2、TNF-α可以增加HL-60細胞和U937細胞TGF-βRⅠ和TGF-β RⅡ蛋白表達。TNF