三氧化二砷及其中間代謝產(chǎn)物引起白血病NB4細(xì)胞自噬的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　以急性早幼粒性白血病細(xì)胞株NB4為研究對象,探討亞砷酸鈉及其中間代謝產(chǎn)物單甲基亞砷酸(MMAⅢ)、二甲基亞砷酸(DMAⅢ)作用于NB4細(xì)胞后與自噬的關(guān)系,進一步研究其作用機理。
　　方法:
　　常規(guī)培養(yǎng)NB4細(xì)胞,取生長良好、狀態(tài)一致的NB4細(xì)胞,隨機分為四組(Con組,iAsⅢ組,MMAⅢ組,DMAⅢ組),加入濃度為1μM的對應(yīng)三種砷化合物,處理不同時間后,透射電鏡、Western-blot和免疫熒光等方

2、法檢測不同砷化合物對NB4細(xì)胞作用與自噬的關(guān)系。Western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　前期研究結(jié)果中MTT結(jié)果顯示,三種砷化合物(iAsⅢ,MMAⅢ和DMAⅢ)中,二甲基中間代謝產(chǎn)物DMAⅢ對NB4細(xì)胞的毒性最大,其次為一甲基中間代謝產(chǎn)物MMAⅢ,iAsⅢ對NB4細(xì)胞的毒性最小。前期研究顯示iAsⅢ可以降解急性早幼粒細(xì)胞性白血病(Acute Promyeloid Leukaemia,APL)特異性

3、融合蛋白PML/RARα,誘導(dǎo)細(xì)胞分化成正常細(xì)胞;單甲基代謝產(chǎn)物MMAⅢ及二甲基代謝產(chǎn)物DMAⅢ處理NB4細(xì)胞后,未能降解融合蛋白PML/RARα,而是誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。
　　前期研究結(jié)果顯示砷中間代謝產(chǎn)物MMAⅢ通過作用于線粒體引起細(xì)胞凋亡,而DMAⅢ通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡。當(dāng)加入凋亡抑制劑后,發(fā)現(xiàn)并不能完全逆轉(zhuǎn)兩種代謝產(chǎn)物引起的細(xì)胞凋亡,提示我們除了線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑引起的凋亡以外,還可能存在另外一種凋亡方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4、細(xì)胞在受到刺激后可以發(fā)生自噬性凋亡,因此我們推測砷中間代謝產(chǎn)物可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了自噬性凋亡。有文獻報道[1],iAsⅢ處理NB4細(xì)胞后,通過自噬途徑降解PML/RARα融合蛋白。透射電鏡結(jié)果顯示,經(jīng)亞砷酸鈉及其代謝產(chǎn)物處理NB4細(xì)胞后,均可見明顯的自噬泡。Western-blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B及Beclin-1,經(jīng)iAsⅢ處理的NB4細(xì)胞均有顯著表達(dá),而MMAⅢ及DMAⅢ處理過NB4細(xì)胞后,自噬相關(guān)蛋白出現(xiàn)一過性顯著表達(dá),兩者

5、之間有顯著性差異。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,對照組LC3B與PML沒有良好重疊,而iAsⅢ處理后LC3B與PML有良好的重疊;MMAⅢ及DMAⅢ處理過NB4細(xì)胞后,LC3B與PML也沒有良好重疊。由此提示iAsⅢ處理NB4細(xì)胞后發(fā)生了自噬現(xiàn)象,而MMAШ及DMAⅢ處理后雖然發(fā)生了自噬現(xiàn)象,但不能降解融合蛋白。
　　為了研究三種不同砷化合物作用NB4細(xì)胞后發(fā)生自噬的相關(guān)機制,我們探討了自噬通路相關(guān)蛋白p-Akt473、p-mTOR的

6、表達(dá),結(jié)果顯示經(jīng)過iAsⅢ處理NB4細(xì)胞后P-Akt473表達(dá)量一過性升高,p-mTOR12 h后明顯下調(diào);MMAⅢ作用于NB4細(xì)胞后,p-Akt473表達(dá)量呈現(xiàn)時間依賴性減少, p-mTOR12 h后明顯下調(diào);DMAⅢ作用于NB4后,P-Akt473表達(dá)量一過性升高,p-mTOR24 h后明顯下調(diào)。結(jié)果提示,iAsⅢ、MMAⅢ及DMAⅢ誘導(dǎo)細(xì)胞自噬均與p-Akt及m-TOR有關(guān),iAsⅢ及DMAⅢ可能通過一過性激活PI3K/Akt--

7、mTOR進而抑制此通路啟動自噬。MMAⅢ通過抑制Akt的磷酸化誘導(dǎo)自噬短暫發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　由以上結(jié)果提示,三種不同的砷化合物作用于NB4細(xì)胞后,亞砷酸iAsⅢ可能通過自噬降解APL特異性融合蛋白PML/RARα,其機制可能與一過性激活PI3K/Akt-mTOR進而抑制此通路誘導(dǎo)自噬有關(guān);單甲基代謝產(chǎn)物MMAⅢ通過抑制Akt的磷酸化誘導(dǎo)自噬短暫發(fā)生;二甲基代謝產(chǎn)物DMAⅢ一過性激活PI3K/Akt-mTOR進而抑制此通