白血病細(xì)胞NB4分化過程中HOXA7的表達(dá)及干預(yù)研究.pdf

1、目的:本課題旨在研究人急性早幼粒白血病(NB4)細(xì)胞增殖分化過程中同源盒基因(Homeobox genes，HOX)A7的表達(dá)情況及全反式維甲酸（All-Trans Retinoic Acid，ATRA）干預(yù)細(xì)胞后其表達(dá)的變化，從而探討HOXA7與急性白血病發(fā)生的關(guān)系。
　　方法:1.采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)體外培養(yǎng)NB4細(xì)胞株，作為急性早幼粒（M3型）白血病模型。2.細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)（Cell Counting Kit-8，CCK8）

2、，確定干預(yù)藥物的最適濃度及干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。3.實(shí)驗(yàn)分組（共四組）:(1)對照組(control):不加藥物，代之以等量1640培養(yǎng)液。(2) ATRA干預(yù)4h組:加入最適干預(yù)濃度的ATRA稀釋液培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)。(3) ATRA干預(yù)48h組:加入最適干預(yù)濃度的ATRA稀釋液培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。(4) ATRA干預(yù)96h組:加入最適干預(yù)濃度的ATRA稀釋液培養(yǎng)細(xì)胞96小時(shí)。4.以ATRA持續(xù)干預(yù)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，觀察各組細(xì)胞的表觀生長情況。5.采用瑞

3、氏姬姆薩染色法觀察、鑒定各組細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)的變化及其生長分化情況。6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，蛋白免疫印跡(Wrestem blot)法，免疫組織化學(xué)方法檢測各組細(xì)胞HOXA7基因及蛋白的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)差異。7.所有數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0處理，采用方差分析，組間均用LSD法兩兩比較，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.CCK8細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)得出:ATRA最佳干預(yù)濃度為1μmol/l，過低濃度對細(xì)胞生長的影

4、響極小，過高濃度毒性大，容易導(dǎo)致細(xì)胞死亡。經(jīng)干預(yù)后，細(xì)胞增殖受到抑制，且48小時(shí)干預(yù)作用即很明顯，以后隨著干預(yù)時(shí)間的增加，細(xì)胞受抑制的作用更加明顯。最佳檢測時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)為4小時(shí)，48小時(shí)和96小時(shí)。2.鑒定細(xì)胞形態(tài):采用瑞氏姬姆薩染色法驗(yàn)證知培養(yǎng)細(xì)胞為急性早幼粒白血病細(xì)胞。正常組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后形態(tài)無明顯改變;各實(shí)驗(yàn)組（培養(yǎng)4，48，96小時(shí)組）細(xì)胞形態(tài)改變，向成熟分化。胞核變得不規(guī)則，大小各異，可見分葉、腎形、蠶豆?fàn)?，?質(zhì)比例縮小。且培

5、養(yǎng)48小時(shí)，這些變化即很明顯。3.在NB4細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程中，加入適宜濃度的ATRA于培養(yǎng)基持續(xù)干預(yù)細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖受到一定程度的抑制，開始向成熟細(xì)胞分化。4.本實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組的HOXA7基因表達(dá)都呈下降趨勢，正常對照組就有表達(dá)，在干預(yù)4小時(shí)后表達(dá)下降，但不明顯，干預(yù)48小時(shí)后下降明顯，而在干預(yù)96小時(shí)后表達(dá)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論: HOXA7基因及蛋白在人急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞中表達(dá)。濃度為1μmol/l