三氧化二砷上調(diào)BNIP3和Beclin1誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤自噬性死亡的研究.pdf

1、研究背景：
　　 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，其惡性程度高，不僅對(duì)視力有極大損害，并可危及生命。在發(fā)達(dá)國(guó)家視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒存活率可達(dá)百分之九十，我國(guó)絕大部分視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者臨床就診時(shí)往往已經(jīng)到了中晚期，對(duì)于中晚期的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療臨床上目前仍以眼球摘除為當(dāng)前主要治療手段。眼球摘除使患兒致殘并給患兒造成心理障礙，放射治療給患兒帶來嚴(yán)重并發(fā)癥并可造成面部畸形，在挽救患兒生命并保住視力是我們迫切期待的，因此需要

2、尋找新的有效化療方法和化療藥物，然而腫瘤細(xì)胞耐藥、逃逸凋亡導(dǎo)致腫瘤對(duì)多種生物化療藥物的耐受使目前腫瘤化療受到極大的限制。
　　 近年來的研究表明腫瘤細(xì)胞能夠以非凋亡途徑發(fā)生細(xì)胞死亡即自噬性細(xì)胞死亡，并有文獻(xiàn)報(bào)道一定程度的自噬可以增強(qiáng)化療療效，若能增強(qiáng)自噬的激活也會(huì)直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自噬性死亡，從而自噬作為一種新的化療手段越來越受科研工作者的關(guān)注。自噬性細(xì)胞死亡又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡是細(xì)胞通過形成自噬溶酶體，降解其所包裹的細(xì)胞器和細(xì)

3、胞內(nèi)廢棄的蛋白內(nèi)容物以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝需要和細(xì)胞器的自我更新，自噬廣泛存在于真核細(xì)胞的病理生理過程中包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展和抗癌治療。正常的細(xì)胞通過清除細(xì)胞內(nèi)過剩、損傷、衰老及廢棄的蛋白和細(xì)胞器維持細(xì)胞自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。隨著90年代自噬相關(guān)基因的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)及自噬調(diào)控機(jī)制逐漸的闡明，通過調(diào)控自噬信號(hào)途徑來治療各種腫瘤，已逐漸被臨床接受并開始使用。先前曾有文獻(xiàn)報(bào)道使用三氧化二砷治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤可導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡

4、。最近又有臨床研究數(shù)據(jù)顯示三氧化二砷在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病患者和多發(fā)性骨髓瘤患者時(shí)并未出現(xiàn)明顯毒副作用且臨床劑量濃度的三氧化二砷安全可靠有效。三氧化二砷可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡途徑的死亡，國(guó)內(nèi)外早已有報(bào)道，而臨床上使用三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞通過凋亡途徑的細(xì)胞死亡為臨床服務(wù)已經(jīng)十分常見。關(guān)于三氧化二砷是否可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生自噬并導(dǎo)致自噬性死亡，國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。
　　 1.研究目的
　　 1.1研究臨床化療藥物三氧化

5、二砷能否誘導(dǎo)SO-Rb50細(xì)胞發(fā)生自噬及自噬的結(jié)局；
　　 1.2尋找三氧化二砷致SO-Rb50細(xì)胞發(fā)生自噬的最佳作用時(shí)間和有效濃度，研究自噬相關(guān)信號(hào)通路的基因表達(dá)，為尋找靶向于自噬分子機(jī)制的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1用梯度濃度的As2O3處理SO-Rb50細(xì)胞，MTT法測(cè)定As2O3對(duì)SO-Rb50細(xì)胞系增殖的抑制作用；
　　 2.2構(gòu)建自噬標(biāo)記物pGFP-LC3轉(zhuǎn)染SO

6、-Rb50細(xì)胞，經(jīng)不同濃度As2O3處理48h后行激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬激活；
　　 2.3 MDC自噬特異性染料行熒光染色檢測(cè)自噬泡，透射電鏡檢測(cè)自噬，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)各處理組MDC熒光顆粒陽性細(xì)胞百分比及凋亡比列；
　　 2.4 RT-PCR、Western blot檢測(cè)As2O3誘導(dǎo)的SO-Rb50細(xì)胞自噬死亡的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活及表達(dá)情況。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1 As2O3對(duì)SO-Rb5

7、0細(xì)胞系的增殖有抑制作用隨給藥時(shí)間和給藥濃度的增加，抑制作用越顯著；
　　 3.2處理組和陽性對(duì)照組可見GFP-LC3綠色熒光蛋白呈點(diǎn)狀聚集在相應(yīng)自噬泡，未處理組GFP-LC3綠色熒光蛋白彌散分布；
　　 3.3空對(duì)照組僅含10％胎牛血清培養(yǎng)基的SO-Rb50瘤細(xì)胞48h后見極少M(fèi)DC陽性熒光顆粒且彌散分布；經(jīng)不同濃度As2O3處理的SO-Rb50瘤細(xì)胞48h后可見明顯聚集的點(diǎn)狀MDC陽性熒光顆粒聚集在細(xì)胞質(zhì)相應(yīng)的自噬發(fā)

8、生區(qū)且MDC陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加；同時(shí)自噬的陽性對(duì)照組Rapamycin處理的SO-Rb50瘤細(xì)胞，全視野下可見半數(shù)以上的SO-Rb50瘤細(xì)胞大量的點(diǎn)狀熒光顆粒聚集；
　　 3.4透射電鏡檢測(cè)見陰性對(duì)照組瘤細(xì)胞形態(tài)基本正常，未見明顯改變;As2O3處理組48h后出現(xiàn)大量雙層膜狀結(jié)構(gòu)及自噬溶酶體，同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)線粒體發(fā)生腫脹，陽性對(duì)照Rapamycin處理組同樣可見自噬溶酶體；
　　 3.5 MDC流式結(jié)果顯示As2O3處理組較

9、空對(duì)照組即10％胎牛血清培養(yǎng)組，自噬泡陽性瘤細(xì)胞百分比隨As2O3濃度遞增而增加，空對(duì)照組未見自噬泡陽性瘤細(xì)胞，自噬發(fā)生48h后隨時(shí)間的延長(zhǎng)自噬百分比呈下降趨勢(shì)；
　　 3.6凋亡流式結(jié)果顯示凋亡在給藥早期百分比低下，而在給藥晚期則凋亡百分比明顯上升；
　　 3.7 RT-PCR見含胎牛血清培養(yǎng)基的未處理組MAPlLC3轉(zhuǎn)錄水平未見表達(dá)，處理組較陽性對(duì)照組條帶稍暗；Western Blot見處理組與未處理組72h后BNI

10、P3和Beclinl均有表達(dá)，處理組較未處理組表達(dá)量明顯增加。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1 As2O3能明顯抑制SO-Rb50瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可誘導(dǎo)SO-Rb50瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，其機(jī)制可能與BNIP3和Beclinl基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)相關(guān);
　　 4.2 SO-Rb50瘤細(xì)胞經(jīng)As2O3處理后，早期自噬發(fā)生呈明顯的濃度時(shí)間依賴性，隨著處理藥物濃度的增大自噬程度增高；4.3自噬在As2O3致SO-Rb50瘤細(xì)胞死亡