PAK5介導E47磷酸化促進結腸癌上皮間質轉化及肝轉移.pdf

1、目的：
　　結腸癌發(fā)病率在中國所有腫瘤發(fā)病率中排名第五位，而且上升趨勢明顯。肝轉移是結腸癌患者的主要致死原因，但是，結腸癌發(fā)生肝轉移的分子機制目前尚不完全清楚，對其更深入的研究將有助于預防和治療結腸癌肝轉移。
　　最近研究表明，上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）可能在結腸癌肝轉移中起主導作用，促進腫瘤細胞侵襲，轉移，增強腫瘤細胞耐藥性等。E47是堿性螺旋環(huán)螺旋轉錄

2、因子(basic helix-loop-helix transcriptionfactors，bHLH)家族成員之一，能與家族內其他成員形成同源二聚體或異源二聚體，結合到靶基因啟動子上行使轉錄調控功能。E47是調控EMT的關鍵分子之一，能結合到上皮標志蛋白E鈣黏素(E-cadherin)啟動子上，抑制E-cadherin轉錄表達，促進波蛋白Vimentin表達，使上皮細胞丟失上皮表型，獲得間質表型，維持EMT。
　　p21激活激酶

3、(p-21 activated kinase，PAKs)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase) Cdc42/Rac1、生長因子信號的下游主要靶蛋白，參與細胞內多個信號轉導通路，發(fā)揮調節(jié)細胞運動、細胞周期演進、基因轉錄、細胞轉化及介導生存與死亡信號等多種效應，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。迄今為止PAK家族共發(fā)現(xiàn)6個成員，根據其結構相似性，將它們分為兩類，Ⅰ類包括PAK1-3，Ⅱ類包括PA

4、K4、5和6。目前對PAK5研究表明，PAK5僅在神經組織發(fā)育過程和結直腸腫瘤組織中表達，與調控細胞骨架和細胞存活的信號通路密切相關。
　　本研究以蛋白質相互作用為前提，在證實PAK5與E47在體內外能夠相互作用的基礎上，探討PAK5與E47介導的EMT之間的關系，及它們對結腸癌細胞侵襲轉移的作用，為明確結腸癌發(fā)生肝轉移的分子機制提供依據。
　　方法：
　　一、PAK5與E47在體內外相互作用的驗證和PAK5磷酸化E4

5、7及其位點的確定
　　1、用GST-pull down實驗鑒定PAK5與E47在體外的相互作用并確定其作用的具體結構域。
　　2、免疫共沉淀實驗確定PAK5與E47在細胞內的相互作用。
　　3、共焦激光掃描顯微鏡觀察PAK5與E47的定位及共定位。
　　4、定點誘變構建GST-E47的不同點突變。
　　5、體外激酶實驗確定PAK5磷酸化E47的位點。
　　6、構建真核表達質粒3×Flag-E47SA，

6、3×Flag-E47SD，分別模擬E47激酶死型和激活型。
　　7、Western Blot檢測腸癌細胞中PAK5對E47的磷酸化作用。
　　二、PAK5磷酸化E47促進結腸癌細胞侵襲和轉移及其作用機制的研究
　　1、Western Blot檢測結腸癌新鮮組織樣本中是否表達PAK5和磷酸化的E47Ser39。
　　2、分析E47 Ser39磷酸化是否和結腸癌臨床病理分期相關。
　　3、相差顯微鏡觀察PAK5

7、磷酸化E47對結腸癌細胞形態(tài)變化的影響。
　　4、Transwell實驗檢測過表達E47，E47 SA，E47SD對結腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響。
　　5、裸鼠結腸癌肝轉移模型檢測E47，E47 SA，E47SD是否促進結腸癌細胞發(fā)生肝轉移。
　　6、Western Blot檢測PAK5磷酸化E47對EMT相關標志蛋白的影響。
　　7、共焦激光掃描顯微鏡觀察PAK5磷酸化E47對核定位的影響。
　　結果：

8、
　　一、PAK5與E47相互作用的驗證和PAK5磷酸化E47的確定
　　1、PAK5與E47能夠在體外直接結合，其作用的具體結構域為PAK5結合E47的1-115aa和301-651aa。
　　2、PAK4與E47能夠在腸癌細胞HCT116和COLO205內相互作用。
　　3、在HCT116細胞中，PAK5與E47發(fā)生共定位。
　　4、定點誘變構建GST-E47的Ser39A，Ser56A，Ser72A，

9、Ser76A，Ser102A，Ser110A點突變。
　　5、體外激酶實驗確定PAK5磷酸化E47的Ser39。
　　6、構建分別模擬E47未磷酸化或E47被磷酸化的真核表達質粒3×Flag-E47Ser39A,3×Flag-E47Ser39D。
　　7、Western Blot檢測結腸癌細胞SW480中PAK5對E47的磷酸化作用。
　　二、PAK5磷酸化E47促進結腸癌細胞侵襲和轉移及其作用機制的研究

10、　　1、結腸癌新鮮組織樣本中表達PAK5表達和E47 Ser39磷酸化。
　　2、E47 Ser39磷酸化與結腸癌淋巴結轉移和遠端器官轉移正相關。
　　3、PAK5磷酸化E47促進結腸癌細胞分散生長。
　　4、過表達E47和E47 Ser39D促進結腸癌細胞遷移及侵襲，而過表達E47Ser39A則不能。
　　5、過表達E47和E47 Ser39D促進結腸癌細胞發(fā)生肝轉移，而過表達E47Ser39A則不能。

11、　　6、PAK5磷酸化E47使上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達降低，間質細胞標志蛋白Vimentin和Fibronectin表達增加。
　　7、PAK5磷酸化E47能促進E47入核。
　　結論：
　　1、PAK5與E47能夠在體內外相互作用。
　　2、激酶實驗確定PAK5磷酸化E47的Ser39。
　　3、PAK5磷酸化E47促進結腸癌發(fā)生肝轉移。
　　4、PAK5磷酸化E47通過促進結腸癌發(fā)