eIF4E磷酸化促翻譯及與蛋白酶體共抑制致結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是惡性腫瘤中發(fā)病率及病死率最高的疾病之一，然而近年來結(jié)腸癌患者的存活率并無太大改善。結(jié)腸癌患者往往對傳統(tǒng)治療產(chǎn)生耐藥性，因此新的治療策略迫在眉睫。蛋白質(zhì)翻譯起始為一類進(jìn)化保守的細(xì)胞生物過程，受營養(yǎng)/生長因子和細(xì)胞能量水平影響而調(diào)控細(xì)胞生長和新陳代謝。腫瘤細(xì)胞快速生長增殖伴隨PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路的激活，蛋白質(zhì)翻譯起始處于這些信號通路的下游樞紐位置。其中，eIF4E是翻譯起始復(fù)合物中受到

2、多層面精確調(diào)控的一個蛋白，其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在多種腫瘤細(xì)胞中上調(diào)。除了在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平受到調(diào)控，eIF4E還在翻譯后修飾水平受到更加精細(xì)和快速的調(diào)節(jié)。在某些腫瘤模型中，只有磷酸化修飾的eIF4E才能發(fā)揮其最大活性并誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，我們推測eIF4E S209磷酸化修飾在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，為了證實(shí)這一假設(shè)，本研究擬構(gòu)建eIF4E S209A KI結(jié)腸癌細(xì)胞株，并比較eIF4E KI和WT兩種HCT11

3、6結(jié)腸癌細(xì)胞生長和新陳代謝情況;同時使用polysome實(shí)驗(yàn)比較兩種細(xì)胞中分子水平的變化并探討其調(diào)控機(jī)制，從而系統(tǒng)性闡述eIF4E S209磷酸化修飾在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制，為靶向eIF4E磷酸化修飾的抗癌新藥研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
　　由于多種癌基因和抑癌基因調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯起始過程，因此這一生物過程的失調(diào)表現(xiàn)在多種癌癥和疾病中。目前靶向蛋白質(zhì)翻譯起始的治療策略已成為一個引人注目的焦點(diǎn)。一些臨床前期研究和臨床研究表明真核細(xì)胞起

4、始因子eIF4A抑制劑Episilvestrol及其類似物Silvestrol均可殺傷多種癌細(xì)胞，其缺陷表現(xiàn)為蛋白質(zhì)翻譯起始也參與正常的細(xì)胞生物過程，高濃度翻譯起始抑制劑可引發(fā)嚴(yán)重的副反應(yīng)。因此聯(lián)合應(yīng)用蛋白質(zhì)翻譯起始抑制劑和其他藥物成為結(jié)腸癌治療的一個選擇。Bortezomib是常用的藥物增敏劑，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)Bortezomib也可協(xié)同Episilvestrol誘導(dǎo)更加顯著的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。
　　目的:
　　本研究旨在

5、探索eIF4E磷酸化修飾在蛋白質(zhì)翻譯中的重要作用并研究靶向蛋白質(zhì)翻譯抑制劑Episilvestrol協(xié)同蛋白酶體抑制劑Bortezomib誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。
　　方法和材料:
　　(1)通過腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建eIF4E磷酸化修飾KI細(xì)胞系，并利用帽依賴性報(bào)告基因、免疫共沉淀和m7 pull down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證eIF4E KI細(xì)胞系對mRNA翻譯的影響;
　　(2)利用MTT、2D/3D克隆形成實(shí)驗(yàn)、BrdU摻入

6、實(shí)驗(yàn)、dsRED、GFP-LC3、流式細(xì)胞、裸鼠實(shí)驗(yàn)等研究eIF4E KI對體內(nèi)外細(xì)胞生長和新陳代謝的影響;
　　(3)利用polysome實(shí)驗(yàn)研究eIF4E KI對細(xì)胞內(nèi)mRNA翻譯的影響;
　　(4)通過MTS，Crystal violet和克隆形成試驗(yàn)研究不同濃度Episilvestrol對HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制和殺傷作用。
　　(5)通過定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)研究高濃度Episilv

7、estrol對凋亡信號通路和線粒體應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用。
　　(6)通過MTS，結(jié)晶紫染色和克隆形成試驗(yàn)研究低濃度Episilvestrol協(xié)同Bortezomib誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制和凋亡的作用。
　　(4)使用Z-VAD抑制劑證實(shí)Episilvestrol協(xié)同Bortezomib誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　(5)通過定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)研究Episilvestrol協(xié)同Bortezomib誘

8、導(dǎo)細(xì)胞凋亡/線粒體應(yīng)激反應(yīng)和CHOP介導(dǎo)DR5上調(diào)的作用。
　　(6)利用FADD敲除細(xì)胞研究Episilvestrol協(xié)同Bortezomib誘導(dǎo)外源性細(xì)胞凋亡。
　　(7)通過MTS，結(jié)晶紫染色，克隆形成，定量PCR和Western blot試驗(yàn)研究Episilvestrol協(xié)同Bortezomib誘導(dǎo)其他結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　(8)通過裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Episilvestrol協(xié)同Bortezomib誘導(dǎo)

9、結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　結(jié)果:
　　(1)通過腺病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建eIF4E磷酸化修飾KI細(xì)胞系;并證實(shí)eIF4E KI抑制mRNA翻譯;
　　(2)eIF4E KI抑制體內(nèi)外結(jié)腸癌細(xì)胞生長和新陳代謝反應(yīng);
　　(3)eIF4E與p-eIF4E優(yōu)先翻譯不同群體的mRNA;
　　(4)2.5nM Episilvestrol對HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞無作用，5nM，10nM，15nMEpisilvestrol可

10、引起HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用，20nM，25nMEpisilvestrol可誘導(dǎo)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。
　　(5)25nM Episilvestrol可抑制HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成，并誘導(dǎo)caspase-3/8，DR5，CHOP的表達(dá)。
　　(6)2.5nM Episilvestrol聯(lián)合5nMBortezomib可有效引發(fā)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD可抑制這一作用。
　

11、　(7)2.5nM Episilvestrol聯(lián)合5nMBortezomib在4h即可上調(diào)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中DR5，CHOP, GADD34的表達(dá)，24h作用更加顯著。
　　(8)DR5的上調(diào)為CHOP介導(dǎo)的，使用CHOP siRNA下調(diào)(knockdown) CHOP表達(dá)可抑制DR5的上調(diào)作用。
　　(9)FADD敲除細(xì)胞可完全抑制Episilvestrol聯(lián)合Bortezomib引發(fā)的細(xì)胞凋亡作用。
　　(1

12、0)2.5nM Episilvestrol聯(lián)合5nMBortezomib可在其他結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)揮類似的殺傷作用。
　　(11)在裸鼠移植瘤試驗(yàn)中，單藥Episilvestrol，Bortezomib對移植瘤的生長影響甚微，二者聯(lián)合可有效抑制移植瘤生長。
　　結(jié)論:
　　這些結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞利用超過正常生理水平的eIF4E磷酸化來達(dá)到在營養(yǎng)缺失等應(yīng)激條件下的生存。聯(lián)合使用蛋白質(zhì)翻譯抑制劑Episilvestrol和蛋白酶