非配體依賴型MET磷酸化介導Src活化參結腸癌細胞對西妥昔單抗耐藥的機制研究.pdf

1、目的
　　對于晚期結直腸癌病人來說，全身化療是最常用最有效的治療手段之一，但兩種常用的化療方案——FOLFOX和FOLFIRI的療效有限，生存期只有15個月左右。EGFR通路活化在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，參與腫瘤細胞的存活、增殖、血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移等。西妥昔單抗（Cetuximab，簡稱C225，商品名愛必妥@）是第一個抗EGFR單克隆抗體，可以在胞外區(qū)競爭性結合EGFR，抑制其與天然配體的結合，從而阻斷了下游信號通路。臨

2、床研究證實西妥昔單抗聯(lián)合化療可有效提高晚期結直腸癌病人的療效，延長生存。2004年，F(xiàn)DA批準西妥昔單抗用于結直腸癌的治療。
　　隨著西妥昔單抗在臨床應用增多和基礎研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)只有KRAS野生型結直腸癌病人應用西妥昔單抗聯(lián)合化療才能提高療效，KRAS突變的病人應用則基本無效或收效甚微。因此，ASCO指南自2009年開始推薦西妥昔單抗只適用于KRAS野生型結直腸癌病人，KRAS突變成為指南推薦的唯一療效預測標志物。通過K

3、RAS基因檢測可以篩選出60％左右的晚期結直腸癌病人是KRAS野生型，但是實際上，在所有KRAS野生型病人中只有60％左右應用西妥昔單抗有效，說明有40％的KRAS野生型結直腸癌病人存在著原發(fā)性耐藥，而在60％對西妥昔單抗有效的病人在應用過程中也部分發(fā)生了繼發(fā)性耐藥，這些耐藥限制了西妥昔單抗的臨床應用。
　　KRAS野生型對西妥昔單抗耐藥的機制有很多:EGFR配體和受體過表達，EGFR泛素化，EGFR核轉(zhuǎn)位，EGFR變異體Ⅲ(EG

4、FRvⅢ)，EGFR同其它跨膜蛋白形成異源二聚體，非受體酪氨酸激酶c-Src間接活化EGFR通路，繞開EGFR通路的其它受體酪氨酸激酶受體的活化（如IGF-1R和HGF/MET通路）等。在眾多耐藥機制中，HGF/MET通路的替代活化和下游Src家族激酶(SFK)活化是EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥的重要原因。
　　HGF/MET通路促進腫瘤增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，MET通路的活化與靶向藥物（包括HER2抑制劑和EGFR抑

5、制劑）耐藥有關。有關HGF/MET通路在耐藥中的作用成為研究熱點，已經(jīng)開展了多個針對HGF/MET通路拮抗劑和抑制劑的臨床研究，具有一定的應用前景。Src家族激酶在受體介導的信號傳遞及細胞間通訊中具有中心調(diào)節(jié)作用，Src活化是HER2抑制劑和EGFR抑制劑耐藥的共同機制。因此，本研究結合了HGF/MET通路和下游的Src因子，深入探討了非配體依賴的MET活化在結腸癌細胞中參與西妥昔單抗耐藥的機制及下游因子Src調(diào)節(jié)MET活化參與耐藥的機

6、制。
　　材料與方法
　　1、采用MTT法測定細胞活力，繪制細胞增殖曲線。
　　2、集落形成實驗觀察藥物作用后細胞克隆的形成。
　　3、Westernblot檢測信號通路相關蛋白變化:MET、EGFR、Src、Akt、ERK、PARP、Caspase-3等。
　　4、免疫共沉降檢測蛋白之間的相互結合。
　　5、采用LipofectamineTAM2000試劑進行瞬時轉(zhuǎn)染下調(diào)MET蛋白表達。
　　

7、6、免疫熒光檢測細胞膜表面p-MET表達。
　　7、統(tǒng)計學處理:每次實驗重復3次，數(shù)據(jù)以均值±標準差（(x)±s）表示，兩組間差異采用Student'st檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　實驗結果
　　1、西妥昔單抗誘導了相對耐藥的結腸癌細胞系Caco-2發(fā)生MET磷酸化
　　通過檢測8種結腸癌細胞(SW480、HCT-116、DLD-1、HT-29、RKO、Caco-2、DiFi和LIM1215)基礎蛋白表

8、達及對西妥昔單抗的敏感性，發(fā)現(xiàn)EGFR、MET和Src及其磷酸化水平的基礎表達與對西妥昔單抗的敏感性沒有明顯相關性。進一步研究西妥昔單抗作用于KRAS、BRAF和PIK3CA均為野生型的Caco-2和DiFi細胞后發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗誘導了KRAS野生型細胞中對西妥昔單抗相對耐藥的Caco-2細胞（西妥昔單抗10μg/ml作用72h時抑制率為15.76±2.42％）發(fā)生p-MET明顯活化，而西妥昔單抗作用于相對敏感的DiFi細胞（西妥昔單抗

9、10μg/ml作用72h時抑制率為40.68±5.46％）后可抑制p-MET表達。通過免疫熒光檢測膜表面的p-MET表達，也證實了西妥昔單抗作用于Caco-2細胞48h后p-MET膜表達增強。根據(jù)這兩種對西妥昔單抗敏感性不同的KRAS野生型結腸癌細胞應用西妥昔單抗后p-MET表達的差異，推測在沒有配體刺激情況下發(fā)生的非配體依賴MET磷酸化參與了結腸癌細胞對西妥昔單抗的耐藥。
　　2、MET抑制劑PHA-665752可抑制西妥昔單抗

10、誘導的p-MET活化，與西妥昔單抗聯(lián)用促進凋亡
　　應用MET抑制劑PHA-665752不僅抑制了Caco-2細胞自身的MET磷酸化，也明顯抑制了西妥昔單抗誘導的p-MET活化，同西妥昔單抗聯(lián)合應用促進了PARP和Caspase-3裂解。MTT結果顯示，西妥昔單抗作用48h的存活率是83.49±1.46％，PHA-665752單藥存活率是70.00±6.87％，兩藥聯(lián)合的存活率是63.12±7.22％，兩藥聯(lián)合較單用西妥昔單抗或單

11、藥PHA-665752提高了抑制率（P值分別為0.013和0.003）。集落形成實驗也證實兩藥聯(lián)合的細胞克隆數(shù)目減少。
　　3、通過siRNA下調(diào)MET蛋白表達后應用西妥昔單抗可進一步抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，促進凋亡
　　采用LipofectamineTAM2000試劑進行瞬時轉(zhuǎn)染下調(diào)Caco-2細胞中MET蛋白表達，兩對siRNA序列可下調(diào)MET蛋白表達約70％，同時可促進PARP裂解，下調(diào)p-Ak

12、t和p-ERK表達。在轉(zhuǎn)染對照siRNA組（ScrambledsiRNA）和METsiRNA組分別加入西妥昔單抗作用48h后發(fā)現(xiàn)，METsiRNA組加入西妥昔單抗較對照組可進一步促進PARP裂解、下調(diào)p-Akt和p-ERK表達，說明MET通路在Caco-2細胞對西妥昔單抗的耐藥機制中起到重要作用。
　　4、西妥昔單抗作用Caco-2細胞48h后發(fā)生p-Src活化，而作用DiFi細胞后p-Src表達被抑制
　　在西妥昔單抗作用

13、于Caco-2細胞中，下游因子Src不斷被活化，下游的p-Akt和p-ERK受到輕度抑制，而西妥昔單抗作用于DiFi細胞后p-Src被抑制，下游的p-Akt和p-ERK被明顯抑制，推測Src活化也參與了Caco-2細胞對西妥昔單抗的耐藥。
　　5、Src抑制劑PP2和達沙替尼(dasatinib)可降低西妥昔單抗誘導的p-MET活化，抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，促進凋亡，增強對西妥昔單抗的敏感性
　　通過

14、應用Src抑制劑PP2和dasatinib發(fā)現(xiàn)，Src抑制劑可明顯抑制西妥昔單抗誘導的p-MET活化，并抑制了下游PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路，增強了PARP和Caspase-3的裂解。西妥昔單抗與Src抑制劑聯(lián)合進一步下調(diào)p-Akt，增強了凋亡作用，并提高了藥物的敏感性。Src抑制劑PP2和西妥昔單抗作用48h的MTT結果顯示，西妥昔單抗的存活率是84.47±4.25％，PP2單藥存活率是64.42±6.14％，兩藥聯(lián)合

15、的存活率是56.51±7.04％，兩藥聯(lián)合較單用西妥昔單抗或單藥PP2提高了抑制率（P值分別為0.024和0.002）。Src抑制劑dasatinib和西妥昔單抗作用48h的MTT結果顯示，西妥昔單抗的存活率是87.98±1.69％，dasatinib單藥存活率是77.13±0.48％，兩藥聯(lián)合的存活率是62.33±2.77％，兩藥聯(lián)合較單用西妥昔單抗或單藥dasatinib提高了抑制率（P值分別為0.001和0.005）。以上結果證實

16、，Src活化與MET活化在西妥昔單抗的耐藥中密切相關，抑制Src活化可進一步增強對西妥昔單抗的敏感性。
　　6、西妥昔單抗誘導Caco-2細胞形成MET/Src/EGFR復合物
　　西妥昔單抗作用于Caco-2細胞后募集了EGFR，增強了MET與Src表達，形成了MET/Src/EGFR復合物，而西妥昔單抗作用于DiFi細胞沒有募集EGFR，并使MET與Src的天然結合減弱。推斷MET/Src/EGFR復合物的形成可能是活化

17、p-MET、產(chǎn)生對西妥昔單抗耐藥的原因之一。應用MET抑制劑PHA-665752可抑制MET/Src/EGFR復合物的形成，Src抑制劑和MET抑制劑均可抑制復合物中MET和Src的磷酸化水平。
　　結論
　　1、非配體依賴的MET磷酸化是KRAS野生型結腸癌細胞對西妥昔單抗耐藥的機制之一。
　　2、MET抑制劑PHA-665752可抑制西妥昔單抗誘導Caco-2細胞發(fā)生的p-MET活化，與西妥昔單抗聯(lián)用促進凋亡，增強

18、了對西妥昔單抗的敏感性。
　　3、下調(diào)MET蛋白表達后應用西妥昔單抗可進一步抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，并促進了凋亡。
　　4、Src活化參與了Caco-2細胞對西妥昔單抗的耐藥，Src活化與MET活化在西妥昔單抗耐藥中密切相關。抑制Src活化可抑制西妥昔單抗誘導的p-MET活化和下游PI3K/Akt通路，促進凋亡，增強了西妥昔單抗的敏感性。
　　5、西妥昔單抗作用于Caco-2細胞后募集了EGFR