重組禽白細胞介素2的生物安全性評價.pdf

1、禽白細胞介素2(IL-2)主要是由激活的T淋巴細胞分泌的一種細胞因子,對機體的免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,因此作為天然的免疫佐劑和免疫增強劑具有很好的應(yīng)用潛力。
　　 將雞和鵝IL-2成熟蛋白的編碼基因分別插入到pET28a(+)原核表達載體多克隆位點,構(gòu)建pET28a(+)-chIL-2和pET28a(+)-goIL-2重組子,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),實現(xiàn)了雞和鵝IL-2基因的體外重組表達。經(jīng)SD

2、S-PAGE鑒定,表達蛋白分子量分別為14.9 kDa和15.0 kDa,Western-blotting分析顯示重組雞和鵝IL-2蛋白能分別被抗雞和鵝IL-2的單克隆抗體和兔多克隆抗體識別。pET28a(+)系統(tǒng)表達的重組雞和鵝IL-2(rchIL-2,rgoIL-2)蛋白大多以包涵體的形式存在,部分以可溶形式存在,經(jīng)鎳柱天然可溶性純化,Bradford法定量產(chǎn)率分別為3.2 mg/L和4.0 mg/L,經(jīng)dot-ELISA鑒定仍能與

3、其特異性的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。鎳柱天然純化的重組雞和鵝IL-2蛋白經(jīng)過濾,過(A)KTA FPLC柱分級分離,得到可溶性的蛋白單體,并在簡單氧化還原緩沖溶液中進行復(fù)性,獲得了重組雞和鵝IL-2蛋白的復(fù)性單體。
　　 為了研究重組禽IL-2蛋白的潛在毒性作用,經(jīng)靜脈和肌肉注射rchIL-2,rduIL-2和rgoIL-2蛋白2次(每周1次),沒有可見的臨床癥狀及組織病理學變化。而經(jīng)靜脈連續(xù)注射(每天2次)rchIL-2和rduIL

4、-2蛋白至第3次時,實驗雞和鴨表現(xiàn)體溫升高,精神沉郁,食欲不振等臨床癥狀,至第5次時所有受試雞和鴨均死亡。相同注射劑量下,鵝的體溫升高不明顯,飲食欲基本正常,至第5次時沒有導(dǎo)致鵝只死亡。病理學分析表明雞、鴨和鵝表現(xiàn)出相類似的病理變化:脾小體中淋巴細胞減少;肺泡壁毛細血管擴張,出血,并有炎性淋巴細胞浸潤;肝細胞出現(xiàn)脂肪變性和水泡變性:腎小管上皮細胞變性、脫落,間質(zhì)中有炎性細胞浸潤等。分別經(jīng)靜脈和肌肉注射方式給予rchIL-2,rduIL-

5、2和rgoIL-2后,不同時間點采集血樣,抗原捕獲ELISA法檢測禽血清中IL-2在體內(nèi)的代謝情況,結(jié)果表明,靜注2 min左右,血清中IL-2水平下降一半,隨后迅速下降,5 min后基本檢測不到;而肌注后2 h左右,血清中IL-2水平達到最高峰,隨后緩慢下降至很低的水平。
　　 經(jīng)肌肉注射rchIL-2,rduIL-2和rgoIL-2蛋白一個月后,用間接ELISA法檢測血清中抗IL-2的抗體,其中試驗雞的血清樣本中95％(24

6、/30)為抗體陰性,5％(6/30)為可疑,試驗鴨和鵝的血清樣本中100％(0/30)為抗體陰性,提示重組禽IL-2蛋白不會引起自身免疫反應(yīng)。經(jīng)肌肉注射rchIL-2,rduIL-2和rgoIL-2蛋白后,分別于第1、5、10、20和30天隨機采集禽的肛拭子,涂布LB平板(卡那抗性),分離細菌,挑斑后擴繁,堿法抽提質(zhì)粒,電泳鑒定未發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒條帶出現(xiàn),說明重組質(zhì)粒的抗性標記基因沒有引起環(huán)境殘留。
　　 以上結(jié)果表明基因工程方法表達