重組雞白細(xì)胞介素2質(zhì)粒（pCI-ChIL-2）作為免疫佐劑的研究.pdf

1、白細(xì)胞介素2(intedeukin-2，IL-2)是由抗原刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。該細(xì)胞因子是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，能促進(jìn)T細(xì)胞增殖、B細(xì)胞分化及分泌抗體，能增強(qiáng)單核細(xì)胞及NK細(xì)胞的殺傷活性。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者報(bào)道共注射IL-2和疫苗，可以提高機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫。直到1979年，雞IL-2(ChIL-2)才首次被克隆成功，隨后體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ChlL-2與哺乳動(dòng)物IL-2有相似的免疫功能。本論文圍繞 pCI-ChIL-2質(zhì)粒作為新型免疫佐

2、劑的安全性和臨床應(yīng)用開(kāi)展了系統(tǒng)研究。取得的研究結(jié)果如下： 本研究室成功克隆ChlL-2基因，并保存在pGEM-T-Easy載體中，利用PCR將 ChlL-2基因亞克隆入pCI真核表達(dá)載體中，上下游引物分別引入EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)，其中下游引物還缺失了終止密碼子。利用EcoKI和SalI對(duì)pEGFP-N1載體進(jìn)行雙酶切，從而獲得EGFP基因。然后將EGFP連入pCI-ChlL-2，構(gòu)建。pCI-ChIL-2-EGFP質(zhì)粒，

3、該質(zhì)粒可以表達(dá)融合蛋白ChlL-2-EGFP。 質(zhì)粒pCI-ChIL-2-EGFP體外轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、外周血單核細(xì)胞(PBMC)，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后8h即可觀察到熒光，36h達(dá)到高峰，此時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為70％、50％和80％左右。轉(zhuǎn)染pCI空質(zhì)粒的細(xì)胞未見(jiàn)到任何熒光。pCI-ChlL-2-EGFP通過(guò)腿部肌肉接種14日齡非免疫雞，通過(guò)RT-PCR、ELISA和熒

4、光顯微鏡檢測(cè)ChlL-2-EGFP在體內(nèi)的表達(dá)情況。接種后8h～14d肌肉接種部位均有融合蛋白的表達(dá)，接種后5d達(dá)到高峰，此時(shí)被轉(zhuǎn)染的肌細(xì)胞占接種部位肌細(xì)胞的5％左右。這些結(jié)果說(shuō)明pCI-ChlL-2-EGFP質(zhì)粒在體內(nèi)外均可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)。 質(zhì)粒pCI-ChIL-2通過(guò)腿部肌肉接種14日齡非免疫雞，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)PCR和特異性PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒在血清、心臟、肝臟、肺臟、脾臟、法氏囊和局部組織的分布情況。結(jié)果表明：接種后2小時(shí)血清

5、中即可檢測(cè)到pCI-ChIL-2，8小時(shí)達(dá)到高峰，7天時(shí)己檢測(cè)不到；pCI-ChIL-2在其余幾種組織器官中存在的時(shí)間比較長(zhǎng)，1～14天各組織器官中均有分布，接種后32天僅有局部組織可以檢測(cè)到重組質(zhì)粒。 質(zhì)粒pCI-ChIL-2與H5亞型禽流感油乳劑滅活苗聯(lián)合應(yīng)用，觀察pCI-ChIL-2對(duì)AIV疫苗的免疫增強(qiáng)效果，原核表達(dá)蛋白rChlL-2與AIV疫苗聯(lián)合應(yīng)用作為對(duì)照。MTT法檢測(cè)各組雞外周血淋巴T細(xì)胞增殖，HI試驗(yàn)監(jiān)測(cè)H5亞

6、型禽流感抗體水平的消長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果表明：pCI-ChlL-2及rChIL-2均能顯著增強(qiáng)AIV疫苗的免疫效果(P<0.05)，pCI-ChIL-2和rChlL-2兩組間差異不顯著(P>0.05)；證實(shí)pCl-ChIL-2質(zhì)重組雞白細(xì)胞介素2質(zhì)粒(pCI-ChlL-2)作為免疫佐劑的研究粒和rChlL-2蛋白均對(duì)H5亞型禽流感疫苗有免疫增強(qiáng)作用。rChIL-2協(xié)同免疫組MTT及HI試驗(yàn)均在第4周達(dá)到峰值，pCI-ChIL-2協(xié)同免疫組峰值出

7、現(xiàn)時(shí)間稍晚，但隨后質(zhì)粒免疫組可維持在更高的水平值。這表明pCI-ChIL-2在體內(nèi)持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。根據(jù)農(nóng)業(yè)部的批復(fù)，對(duì)含雞白細(xì)胞介素2基因的pCI質(zhì)粒作為免疫增強(qiáng)劑在浙江省進(jìn)行了中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放試驗(yàn)和生產(chǎn)性試驗(yàn)。檢測(cè)重組質(zhì)粒在注射局部的殘留時(shí)間及在各臟器和血清中的分布；監(jiān)測(cè)重組質(zhì)粒在動(dòng)物糞便及環(huán)境微生物中的存活情況及環(huán)境微生物中氨芐青霉素的抗性發(fā)生情況；檢測(cè)該質(zhì)粒對(duì)商品化疫苗的免疫增強(qiáng)效果并觀察試驗(yàn)雞的臨床表現(xiàn)情況。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒

8、在多種組織器官中可以殘留較長(zhǎng)時(shí)間，所有試驗(yàn)雞場(chǎng)環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)不存在pCI-IL-2抗性基因Amp的轉(zhuǎn)移情況，對(duì)環(huán)境是安全的。該質(zhì)?？擅黠@提高禽流感、新城疫、傳染性法氏囊病等商品化疫苗的免疫效果且所有試驗(yàn)雞無(wú)任何不良反應(yīng)，對(duì)雞是安全的。 總之，編碼ChIL-2的真核表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)肌肉接種后，可以廣泛地分布于機(jī)體多種組織器官中，持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)。研究證實(shí)pCI-ChIL-2可以有效地提高禽類疫苗的免疫效果。為重組雞白細(xì)胞介素2質(zhì)粒作為免