重組雞白細(xì)胞介素-6-2融合蛋白體內(nèi)外活性研究.pdf

1、為研究以重組雞白細(xì)胞介素-6/2融合蛋白（rChIL-6-Linker-ChIL-2，重組融合蛋白）為主要成分的雞基因工程復(fù)合免疫增強(qiáng)劑，本研究分別進(jìn)行了重組融合蛋白在雞體內(nèi)外生物學(xué)活性、以及不同劑型的重組融合蛋白對不同種類疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究。采用 ELISA方法分別檢測重組融合蛋白在體外與抗 ChIL-6、ChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)活性，采用 MTS方法分別檢測重組融合蛋白體外促 T、B淋巴細(xì)胞增殖活性。進(jìn)行了不同濃度（原

2、液、1:8、1:32、1:64倍稀釋）的重組融合蛋白在體內(nèi)活性比較研究；采用篩選出的1:8倍稀釋的重組融合蛋白、1:8倍稀釋的單一 rChIL-6/rChIL-2蛋白對照、1:4倍稀釋的 rChIL-6和rChIL-2蛋白等體積混合物對照分別接種于28日齡 SPF雞，進(jìn)行體內(nèi)活性比較研究；分別采用MTS法、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA方法檢測以上各組試驗(yàn)雞接種前后不同時間外周血中 T/脾臟 B淋巴細(xì)胞增殖活性、雞外周血中CD3+CD4+/CD

3、3+CD8+ T淋巴細(xì)胞的百分含量及血清中 Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平等指標(biāo)，根據(jù)以上指標(biāo)評價不同蛋白的體內(nèi)活性。
　　在以上研究基礎(chǔ)上，將1:8倍稀釋的重組融合蛋白水劑與 NDV（ LaSota株）活疫苗接種于28日齡 SPF雞，分別采用 MTS法、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA方法和 HA/HI的方法檢測接種前后不同時間各組雞 T/B淋巴細(xì)胞增殖活性、雞外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞的百分含量、血清中Th

4、1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平及 NDV免疫抗體水平等指標(biāo)；將1:8倍稀釋的重組融合蛋白水劑與NDV滅活疫苗分別同時種于35日齡的 SPF雞，重組融合蛋白與 NDV（LaSota株）混合凍干后分別采用點(diǎn)眼滴鼻和肌肉注射方式接種114日齡的 SPF雞，重組融合蛋白水劑和凍干劑與重組禽流感病毒（H5 Re-6/Re-7）二價滅活疫苗分別同時接種于140日齡雞，采用 HA/HI的方法檢測以上不同實(shí)驗(yàn)組雞的 NDV或AIV（H5 Re-6/Re-

5、7）免疫抗體水平。
　　結(jié)果：重組融合蛋白在體外可以和抗 ChIL-6、ChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，其ChIL-6、ChIL-2相對含量分別為59.56 pg/mL、53.44 pg/mL；稀釋度≤1:8的重組融合蛋白在體外刺激 T、B淋巴細(xì)胞增殖活性顯著高于 ConA對照組，與原液差異不顯著；當(dāng)稀釋度>1:8時，重組融合蛋白體外活性隨濃度的降低而下降。1:8倍稀釋的重組融合蛋白的體內(nèi)活性(刺激 T、B淋巴細(xì)胞增殖，提升雞

6、外周血中CD3+CD4+、CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞的百分含量及血清中Th1、Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平等)高于1:32、1:64倍稀釋，與原液差異不顯著；相同濃度的重組融合蛋白在體內(nèi)的生物學(xué)活性高于單一的 rChIL-6、rChIL-2蛋白對照，且與蛋白混合物組差異不顯著。1:8倍稀釋的重組融合蛋白水劑刺激 T、B淋巴細(xì)胞增殖，提升雞外周血中 CD3+CD4+、CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞的百分含量、血清中 Th1/Th2型細(xì)胞因子表

7、達(dá)水平及 NDV活疫苗免疫抗體水平等均高于 NDV疫苗對照和相同稀釋度的 rChIL-6/rChIL-2對照，與蛋白混合物組差異不顯著；與 NDV活疫苗對照組相比，同時接種重組融合蛋白水劑和疫苗組，免疫后7 d~42 d可提高1.0~1.9個NDV抗體HI滴度；分別較rChIL-6、rChIL-2對照組提高0.2~0.7、0.2~1.1個滴度。與 NDV滅活疫苗對照組相比，接種重組融合蛋白水劑后14 d~49 d，可提高0.8~1.3個

8、NDV抗體HI滴度；分別較rChIL-6、rChIL-2對照組提高0.4~0.9、0.4~1.1個滴度。采用點(diǎn)眼滴鼻方式接種重組融合蛋白與NDV（LaSota株）混合凍干劑后14 d~63 d可提高NDV抗體HI滴度0.8~2.9個，其免疫增強(qiáng)作用顯著優(yōu)于肌肉注射方式。與AIV（H5 Re-6/Re-7）二價滅活疫苗對照組相比，重組融合蛋白水劑、凍干劑與二價滅活疫苗共接種后14 d~35 d可分別提高AIV（H5 Re-6）免疫抗體0.

9、6~1.5、0.1~0.9個滴度，可分別提高AIV（H5 Re-7）免疫抗體0.4~1.3、0.5~1.5個滴度。
　　結(jié)論：重組融合蛋白在雞體內(nèi)、外均具有良好的生物學(xué)活性，其體內(nèi)外活性具有一定的相關(guān)性；重組融合蛋白在體內(nèi)、外發(fā)揮了 ChIL-6、ChIL-2雙重生物學(xué)活性；重組融合蛋白水劑在體內(nèi)對不同種類疫苗均具有免疫增強(qiáng)作用，重組融合蛋白凍干制劑與水劑對疫苗的免疫增強(qiáng)作用無明顯差異；重組融合蛋白與疫苗共同凍干劑對雞體的免疫增強(qiáng)