不同亞型重組人白細(xì)胞介素8蛋白表達(dá)、純化與活性檢測(cè).pdf

1、目的:白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)是一種多功能性的細(xì)胞因子，屬于趨化因子CXC亞家族的一員，是體內(nèi)炎癥反應(yīng)應(yīng)答的主要介質(zhì)之一。除常規(guī)生化檢測(cè)方法之外，尚未有報(bào)道利用蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)檢測(cè)(Protein FragmentComplementation Assay，PCA)技術(shù)對(duì)IL-8的生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定。本文利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)重組人源性IL-8的高效表達(dá)、純化，并利用PCA技術(shù)實(shí)現(xiàn)重組IL-8活性檢測(cè)。

2、　　方法:將3種不同亞型的重組人IL-8基因片段分別與表達(dá)載體pME-15-6His和pET-32a連接，轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293F和大腸桿菌BL21(DE3)，進(jìn)行IL-8的表達(dá)。采用IMAC親和層析柱對(duì)重組人IL-8進(jìn)行純化。根據(jù)PCA技術(shù)，構(gòu)建了Split-TEV GPCR激活檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)純化的目的蛋白進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pME-15-6His/IL-8 formⅠ，前體IL-8

3、基因在HEK293F中正確分泌表達(dá)，其N端信號(hào)肽（殘基1-20）被切除，經(jīng)過純化得到的重組蛋白為成熟的IL-8 formⅠ(殘基21-99);成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a/IL-8 formⅡ和pET-32a/IL-8 formⅢ，N端融合了Trx標(biāo)簽的重組蛋白在大腸桿菌中正確表達(dá)，經(jīng)過純化和重組腸激酶酶切得到的重組蛋白為IL-8 formⅡ（殘基23-99）和IL-8formⅢ（殘基28-99）。純化后的重組人IL-8對(duì)其天然