豬白細胞介素2-6嵌合基因的融合表達及活性研究.pdf

1、疫苗免疫接種是控制豬傳染病的重要手段,但由于疫苗自身的缺點以及免疫抑制病的發(fā)生而帶來的疫苗免疫失敗、免疫保護率低等情況時而發(fā)生。因此,提高疫苗的免疫力和免疫保護效果對控制豬傳染病具有重要意義。細胞因子作為免疫佐劑可以提高疫苗的免疫效果、增強動物機體的免疫力,因此細胞因子作為免疫增強劑的研究成為目前研究的熱點。
　　 白細胞介素-2(1L-2)、白細胞介素-6(IL-2)分別屬于Th1、Th2型細胞因子,介導細胞免疫與體液免疫。大

2、量研究表明,IL-2、IL-6可以作為免疫佐劑增強疫苗的免疫效果。為探討IL-2/IL-6用作疫苗佐劑的協(xié)同免疫增強作用機理及效果,研究高效豬基因工程免疫增強劑獲得一種能夠平衡Th1和Th2應答的新型、高效的免疫增強劑。本研究從LPS脂多糖刺激過的豬脾臟細胞中提取PoIL-6 RNA,進一步構建rpQE-30/PoIL-6原核表達質(zhì)粒,對其原核表達的蛋白進行純化,研究其生物學活性及對脾臟細胞的增殖活性。然后采用重疊延伸PCR(splic

3、ing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)技術將豬白介素-2成熟肽基因(PoIL-2)和豬白介素-6成熟肽基因(PoIL-6)構建成重組嵌合基因(PoIL-2-linker-PoIL-6)并克隆入pGEM-T easy克隆載體；將含PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因的重組克隆陽性質(zhì)粒經(jīng)BamtHⅠ、HindⅢ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的原核表達載體pQE30粘端連接,篩選陽性重組表達質(zhì)粒在E.Co

4、il中進行表達。對表達的重組融合蛋白(rPoIL-2-linker-PoIL-6)通過尿素變性、復性液復性、PBS溶液透析等步驟進行純化并進行蛋白含量測定。分別檢測rPoIL-6、rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白與抗PoIL-2、PoIL-6單抗發(fā)生特異性免疫反應及促豬外周血T淋巴細胞、豬脾臟細胞的增殖活性的活性。
　　 結果表明:成功克隆了rPoIL-6成熟肽基因,基因全長573bp；并構建成功rpOE-30/P

5、oIL-6原核表達質(zhì)粒,其在大腸桿菌系統(tǒng)中表達的rPoIL-6蛋白分子量大小約為20KD;經(jīng)純化后的蛋白質(zhì)純度在95％以上;rPoIL-6蛋白能和抗PoIL-6單抗發(fā)生特異性反應,MTS法檢測得出,rPoIL-6蛋白活性為1.23×106UI/mg,具有促進豬脾臟細胞的增殖活性。
　　 成功構建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重組原核表達質(zhì)粒rpQE-30/PoIL-2-linker-PoIL-6；表達的r

6、PoIL-2-linker-PoIL-6蛋白經(jīng)純化后純度在96％以上。rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白分別可與抗PoIL-2、PoIL-6單抗發(fā)生特異性免疫反應,并可顯著促進豬外周血T淋巴細胞和豬脾臟細胞的增殖。rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白促豬外周血T淋巴細胞和脾臟淋巴細胞增殖活性也與濃度呈現(xiàn)相關性,相對而言,rPoIL-2-linker-PoIL-6和rPoIL-2蛋白對照具有明顯促豬外周血T淋巴細胞增

7、殖所需要的最低濃度較高(最大稀釋度分別為1:256,0.598ug/ml;1:512,0.322ug/mL),且rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白的促增殖活性稍優(yōu)于相同稀釋度的rPoIL-2蛋白對照。與IL-2的促外周血T細胞增殖活性所需要的蛋白劑量不同,極低濃度(最大稀釋度1:214)的rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白、rPoIL6蛋白和rhIL-6蛋白即可刺激豬脾臟淋巴細胞的增殖；相對而言,rPoIL-2-

8、linker-PoIL-6蛋白的促豬脾臟淋巴細胞增殖活性稍優(yōu)于rPoIL-6蛋白對照,但二者均稍低于rhIL-2標準品。這表明rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在動物體外具有單rPoIL-2、rPoIL-6蛋白疊加的生物學活性,且其活性可能優(yōu)于兩種單rPoIL-2、rPoIL-6蛋白混合應用。
　　 本研究成功構建了rpQE-30/PoIL-6原核表達質(zhì)粒、PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重組原核