微型腺病毒載體介導(dǎo)狗FIXcDNA的表達(dá)及安全性檢測(cè)系統(tǒng)的建立.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文微型腺病毒載體介導(dǎo)狗FIXcDNA的表達(dá)及安全性檢測(cè)系統(tǒng)的建立姓名：王飛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：盧大儒2000.6.1! 墜! 竺堅(jiān)莖望墮生二二二塑墨———————————————_ 三摘 要腺病毒載休因其轉(zhuǎn)染效率高，制各方便，可直接注射等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于單基因遺傳病、惡性腫瘤等的基因治療。但由于腺病毒載體本身可誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，不能長(zhǎng)期穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)，而且其包裝容量有限。所以近年來人們一直致力于降低

2、腺病毒載體免疫原性，增加其包裝容量的研究。) 一本論文在第一代腺病毒載體介導(dǎo)人F I X 表達(dá)的基礎(chǔ)上．開展了微型腺病毒基因治療血友病的初步研究。用缺失所有腺病毒結(jié)構(gòu)基因、同時(shí)攜帶狗F Ⅸ基因和綠色熒光蛋白( 6 F P ) 基因的微型腺病毒載體( m A d ) ，進(jìn)行離體、活體表達(dá)的嘗試，以期達(dá)到延長(zhǎng)外源基因的表達(dá)時(shí)f ．- 1 ，降低腺病毒免疫原性的目的。f 通過在2 9 3 包裝細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增微型腺病毒載體( m A d ) 及輔助

3、性腺病毒( A d H ／3 ) ，并氯化銫梯度超離心純化后，得到了以m a d 為主及以A d H ／} 為主的兩種腺病毒純化液。將兩種腺病毒液進(jìn)行離體及活體轉(zhuǎn)雜后，檢測(cè)得F Ⅸ表達(dá)量在離體培養(yǎng)細(xì)胞上清中達(dá)5 7 u g／m 1 ／1 0 6 c e l l s ／2 4 h r ，活性達(dá)7 8 鬈：F I X 剔除小鼠血漿中為- 6 母_ r l g ／m l ，活性達(dá)6 7 ％，持續(xù)表達(dá)f 4 周以上。 ，”通過P C R 方法及

4、常規(guī)石蠟包埋切片方法．未檢測(cè)出宿王細(xì)胞內(nèi)有復(fù)制活性的腺病毒，小鼠各臟器未見明顯毒性反應(yīng)。以上結(jié)果顯示：m a d 介導(dǎo)的d F Ⅸ基因在離體及活體內(nèi)均有高效表達(dá)，初步安全性檢測(cè)無明顯毒性，但由于m a d 在純化日寸，與A d H B 不能完全分開，導(dǎo)致m a d 中有約1 ％的A d H口的污染，最終導(dǎo)致F I X 在表達(dá)1 4 周后被清除。因此．在將來的基因治療的應(yīng)用中，m A d本身的穩(wěn)定性及應(yīng)用系統(tǒng)還需做一定的改進(jìn)，以適應(yīng)高效、