腺病毒載體介導(dǎo)的siRNA對3T3-L1細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分細(xì)菌內(nèi)同源重組制備攜帶脂聯(lián)素Acrp30siRNA的腺病毒載體。 目的:細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶脂聯(lián)素Acrp30的siRNA腺病毒載體。 方法:首先將鼠U6啟動子和脂聯(lián)素Acrp30 siRNA的cDNA克隆入穿梭質(zhì)粒pshuttle，卡那霉素抗性篩選陽性重組子，雙酶切并測序鑒定正確后，將重組子用Pme Ⅰ線性化后電穿孔入電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，與pAdeasy-1在BJ5183內(nèi)同源重組，Pac Ⅰ消化

2、鑒定產(chǎn)生30kb和4.5kb或3.0kb的為陽性重組子，將陽性重組子在超感受態(tài)菌XL10-Gold中擴(kuò)增重組腺病毒質(zhì)粒后，Pac Ⅰ消化，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，包裝擴(kuò)增攜帶脂聯(lián)素Acrp30的siRNA重組腺病毒。 結(jié)果:成功構(gòu)建脂聯(lián)素Acrp30 siRNA腺病毒載體，測得滴度為4.5×108：3.7×108；5.6×108 PFU/ml。 結(jié)論:成功構(gòu)建脂聯(lián)素Acrp30 siRNA腺病毒載體，為下一步脂聯(lián)素

3、Acrp30 siRNA重組腺病毒在脂肪細(xì)胞內(nèi)抑制脂聯(lián)素表達(dá)打下基礎(chǔ)。 第二部分腺病毒載體介導(dǎo)的Acrp30siRNA抑制脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素。 目的:攜帶Acrp30 siRNA的重組腺病毒感染誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，檢測Acrp30siRNA是否能有效抑制脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的mRNA和蛋白的表達(dá)。 方法:IBMX+胰島素+地塞米松誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)分化小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用重組腺病毒(MOI100